绵羔羊卵母细胞体外发育能力的研究

摘要

羔羊体外胚胎生产技术已成为家畜繁殖领域中的研究热点之一,但由于羔羊未达到性成熟和体成熟阶段,自然条件下无法收集到卵母细胞。因此,需要在羔羊的特定阶段,采用外源激素诱导,将获得卵母细胞作为实验材料。而本文是以成年羊卵母细胞研究为基础,研究了外源激素对诱导羔羊卵泡发育的作用、亮甲酚蓝染色液(BCB)与PDE3抑制剂Milrinone在羔羊卵母细胞体外培养中的应用,旨在提高羔羊卵母细胞的体外发育能力,实验分下面四部分:
　　1.卵泡直径对绵羊卵母细胞体外发育能力的影响
　　以屠宰场绵羊卵巢为材料,收集不同直径卵泡中的卵母细胞,小卵泡(小于2 mm)、中卵泡(2~5 mm)、大卵泡(大于5 mm),以研究各卵泡直径所占比例、卵泡直径对卵母细胞的回收、卵母细胞直径、GSH含量及体外发育能力的影响。结果表明,三种卵泡所占比例差异极显著(P<0.01);卵母细胞的回收率间无差异(P<0.05),但小卵泡中的卵母细胞利用率极显著低于其他两组(P<0.01);小卵泡卵母细胞的直径极显著低于其余两组(P<0.01);体外成熟培养24 h后,中、大卵泡卵母细胞的成熟率和卵母细胞GSH含量均显著高于小卵泡卵母细胞(P<0.05);经孤雌激活体外培养后,中、大卵母细胞囊胚率极显著高于小卵泡卵母细胞(P<0.01)。因此,卵泡大于2 mm的卵母细胞适合体外培养和体外胚胎的生产。
　　2. BCB染色液对绵羊不同直径卵泡卵母细胞的筛选作用
　　为了探讨亮甲酚蓝(BCB)染色液对绵羊不同直径卵泡卵母细胞的筛选作用,本研究将筛选后的卵母细胞进行孤雌激活,比较不同组卵母细胞的后期发育能力。结果表明,直径大于5 mm卵泡中的卵母细胞阳性率极显著高于5 mm以下卵泡组(P<0.01);卵泡直径大于5 mm中BCB+组卵母细胞孤雌激活后的体外培养效率显著高于小于2 mm组和2~5 mm组;不同实验组卵母细胞孤雌激活后获得的囊胚总细胞数结果显示,在BCB+组卵母细胞中,卵泡直径大于2mm组高于直径小于2 mm组(P<0.01);BCB-组各组间没有差异(P>0.05);未经染色的卵母细胞中,直径大于2mm组也显著高于直径小于2 mm组(P<0.05)。因此,直径大于2 mm卵泡的卵母细胞用BCB染色液筛选后更适合体外培养,并且大于2 mm BCB+组卵母细胞后期发育潜能更强。
　　3.外源激素诱导羔羊卵泡发育的研究
　　为了优化并提高羔羊卵泡的发育效率,本实验从FSH剂量、日龄、卵泡直径、体重及品种等5个方面进行了研究。结果表明,FSH总剂量为160 IU的羔羊卵泡发育效果显著高于320 IU(P<0.05),6周龄羔羊的卵泡发育效果显著高于4~5周龄、7~8周龄(P<0.05),8~12 Kg羔羊卵泡发育效果显著高于12 Kg以上的(P<0.05)。6周龄羔羊被注射等剂量FSH,萨福克和美利奴对激素的诱导效果显著高于特克赛尔(P<0.05)。因此,用160 IU FSH处理6周龄,体重在8~12 Kg的萨福克羔羊,卵泡发育效果较好。
　　4. BCB染色液与Milrinone在羔羊卵母细胞体外培养中的应用研究
　　为了提高羔羊体外胚胎生产效率,研究了BCB染色液对羔羊卵母细胞的筛选作用及milrinone对BCB-组卵母细胞的影响。结果表明,13μM BCB+组卵母细胞的体外培养效率与26μM组无显著差异(P>0.05)。筛选后的BCB+组卵母细胞直径和GSH含量显著高于BCB-(P<0.05),而二者都与成年羊差异不显著(P>0.05)。BCB-卵母细胞经milrinone抑制6 h后,体外胚胎发育率显著高于BCB-组和对照组,而与成年羊无显著差异(P>0.05)。因此,BCB染色液与milrinone相结合,可以提高羔羊卵母细胞的体外培养效率。

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常用缩略语中英文对照表

第一部分 文献综述

1 供体羔羊的选择

2 外源激素诱导羔羊的卵泡发育

3 采集卵母细胞

4 体外成熟研究进展

5 体外受精及早期胚胎培养

6 羔羊胚胎移植及妊娠

7 研究目的及意义

第二部分 实验研究第一章 卵泡直径对绵羊卵母细胞体外发育能力的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二章 BCB染色液对绵羊不同直径卵泡卵母细胞的筛选作用

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 外源激素诱导羔羊卵泡发育的研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 BCB染色液与Milrinone在羔羊卵母细胞体外培养中的应用研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

全文结论与创新点全文结论

创新点

参考文献

附录

致谢

作者简介

石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表