天然彩色棉纤维色素物质的鉴定及其代谢机制研究

摘要

目的：天然彩色棉是一种成熟纤维具有天然色彩的棉花，其健康、环保的特性迎合了市场的需求，具有广阔的发展前景。但是，天然彩色棉色彩单调、色素遗传不稳定等严重制约了彩色棉的开发和利用。由于缺乏除棕、绿两种颜色之外的其他颜色的种质资源，通过常规的杂交手段难以解决目前彩色棉颜色单调的问题。人们寄希望利用基因工程手段来改变彩色棉纤维的颜色，完成这项工作的前提是明确彩色棉纤维色素形成的分子机制。因而，分离、鉴定彩色棉纤维色素物质并解析其形成的分子机制将为利用基因工程手段改良彩色棉纤维色泽品质提供理论基础。
　　方法：⑴通过MALDI-TOF MS、NMR及HPLC等方法，鉴定棕色棉纤维中原花色素的的种类、分子质量、聚合度、基本结构单元及其空间连接方式；分析原花色素合成、转运过程中的关键基因GhANR、GhLAR和GhMATE表达模式，利用Gateway技术构建GhANR基因的过表达和干扰载体，分别转化白色棉和棕色棉。⑵用脂溶性和水溶性提取液，提取分离绿色棉纤维色素物质。克隆绿色棉纤维中的4CL基因，筛选绿色棉纤维中优势表达的4CL基因，利用Gateway技术构建其过表达和干扰载体，转化白色棉和绿色棉。
　　结论：①棕色棉纤维中原花色素是由90.1％的原翠雀素和9.9%原花青素组成，其基本结构单元黄烷-3-醇的空间立体结构为2,3-順式构型（即表棓儿茶素/表儿茶素）；白色棉纤维中原花色素大约是由等比例的的原翠雀素和原花青素（约为1:1.05）组成，其基本结构单元黄烷-3-醇结的空间立体结构为2,3-順式构型（即表棓儿茶素/表儿茶素）。另外，白色棉纤维中的原花色素结构中还存在一定比例的棓酰基。在棕色棉纤维发育过程中原花色素的含量和聚合度急剧增加，30DPA达到最大，随后逐渐减少。与白色棉相比，棕色棉纤维中原花青素含量显著高于白色棉纤维，聚合度也较白色棉大。香草醛-盐酸反应实验表明，成熟的棕色棉和白色纤维均检测不到原花色素，但是，未成熟棕色棉纤维中含有大量的原花色素，而白色棉从发育15DPA纤维开始原花色素含量明显减少。Borntrager's反应实验表明，随着纤维发育，醌类化合物在棕色棉中含量逐渐增多，而且在成熟纤维中含量仍然很高。相反，未成熟的和成熟的白色棉纤维均没有颜色变化，表明白色棉纤维中没有醌类化合物的积累。上述实验表明，原花色素氧化成的醌类物质是棕色棉颜色形成的直接原因，原花色素在棕色棉纤维中的形成是棕色棉纤维颜色形成的根本原因。在棕色棉纤维发育过程中，GhANR基因的转录水平很高，而GhLAR的表达几乎就检测不到。基因GhMATE1a和GhMATE1b均具有12个跨膜域，聚类分析发现，其与拟南芥TT12、苜蓿MATE1等蛋白聚为一类，暗示棕色棉纤维中GhMATE1a和GhMATE1b可能与无酰基化修饰的原花色素前体的转运有关。表达分析还发现，GhMATE1a和GhMATE1b在棕色棉纤维中的转录水平比在白色棉纤维高，分别在21DPA和27DPA达到最大转录水平。克隆并构建了GhANR的过表达和干扰载体，转化棉花，得到7棵过表达阳性再生植株T0代，收获T1种子，待进一步验证。②从绿色棉纤维脂溶性提取溶液中分离得到苹果酸甲酯和苹果酸二甲脂，没有发现有颜色化合物（除我们前期分离得到的咖啡酰基甘油酯类外）；水溶性提取液中分离得到没食子酸和鞣花酸（主要是没食子酸）。由于没食子酸及其衍生物与葡萄糖或多酚可以通过酯键形成水解单宁，呈现淡黄色至浅棕色夜色，推测绿色棉纤维色素可能也与苯丙烷类衍生物代谢途径有关。从绿色棉纤维中克隆获得了三个4CL基因，生物信息学分析发现这3个基因均具有MotifⅠ-AMP结合功能域和MotifⅡ保守域；通过与已知功能基因聚类分析和3个4CL基因在棉花各组织中中的表达分析，推断Gh4CL1可能参与绿色棉现在中黄酮类色素物质的代谢，Gh4CL3可能参与绿色棉现在中咖啡酸及其衍生物的代谢，Gh4CL4参与棉纤维中木质素（也可能是纤维素）的代谢。基于此，构建Gh4CL3的表达载体和干扰载体，转化棉花，得到7棵阳性过表达再生植株T0代，收获T1种子，待进一步验证。

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前言

第一章 文献综述

1.1 天然彩色棉研究进展

1.2 黄酮类化合物的分离、鉴定

1.3原花色素的研究进展

1.4 咖啡酸及其衍生物的研究进展

1.5 本研究的目的

第二章 棕色棉纤维中原花色素的分离、鉴定

2.1材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论与结论

第三章 原花色素的代谢分子机制

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论与结论

第四章 绿色棉纤维色素分析

4.1材料与方法

4.2结果与分析

4.3讨论与结论

第五章 Gh4CL基因的克隆与转化

5.1 材料与方法

5.2结果与分析

5.3 讨论与结论

第六章 全文结论与创新点

6.1主要结论

6.2特色与创新点

参考文献

附录

致谢

作 者 简 介

石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表