PMA-qPCR技术用于结核耐药菌快速鉴别诊断方法的初步研究

摘要

目的:为建立结核杆菌快速药敏检测技术,缩短获得药敏检测结果的时间,及时为患者提供正确的治疗方案。我们将PMA-qPCR偶联技术应用于结核杆菌耐药诊断,以期对结核杆菌耐药性做出快速检测。
　　方法:根据GenBank中公布的结核分支杆菌16 sRNA基因的保守序列选取一段长为206 bp的基因片段设计引物。以qPCR所得初始模板量的多少作为PMA抑制死菌扩增的判定标准。用二甲基亚砜将PMA稀释到0.5 mg/ml,并将PMA与结核分枝杆菌样品进行作用,用以选取和优化以下试验条件:
　　(1)终浓度为3 ug/ml的PMA与结核单菌悬液作用,设置不同曝光时间,选取PMA与DNA共价交联及游离PMA完全钝化的最佳曝光时间,并以此作为后续试验中的曝光时间;
　　(2)用热灭活、超声裂解和紫外照射法将结核杆菌杀死并分别与3 ug/ml的PMA作用,曝光后进行qPCR,通过CT值分析PMA对死菌扩增的抑制效果,选取结核分支杆菌死菌悬液制备的最佳方法;
　　(3)不同浓度的PMA与结核分支杆菌活菌相互作用后,在650 W卤素灯下曝光15 min,根据qPCR结果选择不抑制结核分支杆菌活菌扩增的最小PMA浓度;
　　(4)用热灭活法制备结核死菌悬液,在同(3)的条件下选择完全抑制结核分枝杆菌死菌扩增的最小PMA浓度;
　　(5)3 ug/ml的PMA与不同比例活/死菌混合液相互作用,确定在活菌/死菌混合液中PMA能抑制死菌扩增时死菌的最小百分比;
　　(6)将抗结核药物添加到结核分支杆菌单菌悬液中,使药物终浓度达到抑制结核生长的最小抑菌浓度,不添加药物组为对照组。培养3天后,按照上述实验确定的参数条件将终浓度为3 ug/ml的PMA与药物组和对照组结核杆菌悬液相互作用,qPCR检测各组间的CT值,根据药物组和对照组CT值之间的差异(△CT或2△C T)判定结核菌的耐药情况。
　　结果:(1)结核分支杆菌16s RNA基因种属特异性强,引物二聚体现象不明显,不影响qPCR结果的分析,可用于PMA-qPCR偶联技术进行试验;
　　(2)PMA的最佳曝光时间为15 min;
　　(3)热灭活致死法是制备结核杆菌死菌悬液的最佳方法;
　　(4)PMA不抑制结核分支杆菌活菌扩增的最小浓度为20 ug/ml;
　　(5)PMA完全抑制死菌扩增的最小浓3 ug/ml;
　　(6)结核杆菌活/死菌混合体系中的死菌比例在50％-80%之间时,PMA可以实现对活菌和死菌的有效区分,并能选择性检测出活菌来;
　　(7)PMA-qPCR技术能有效检测结核分支杆菌的耐药性。
　　结论:本研究初步建立了结核杆菌耐药性检测方法,缩短了耐药结核检测时间,有望成为结核耐药检测的一种新标准。

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前言

第一章 文献综述结核分支杆菌耐药性检测技术的研究进展

1 传统的生长检测为基础的药敏试验

2 以快速培养生长检测为基础的药敏试验

3 以检测基因突变为基础的快速药敏试验

4 商品化的突变检测技术

5 直接测序法

6 高分辨率溶解曲线（HRM）

叠氮类染料用于活性菌的选择性检测

第二章 实验部分实验一 三种死菌悬液制备方法对PMA-qPCR结果的影响

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

实验二 PMA-qPCR快速检测结核活菌方法的建立

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

实验三 PMA-qPCR技术应用于结核耐药菌的快速鉴别诊断方法的初步研究

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

实验总结

创新点

参考文献

致谢

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