嗜吞噬细胞无形体msp2、msp4蛋白的原核表达及免疫原性研究

摘要

嗜吞噬细胞无形体是经蜱传播的专性的革兰氏阴性小球杆菌,还是重要的人兽共患病病原体,不仅可以感染人,也可以感染牛羊反刍动物,及马和狗等家养动物。自20世纪90年代初于美国首次发现以来,澳洲、欧洲多国、韩国及我国先后均有报道,且近年来呈上升趋势。由于该病的临床多表现为急性不明原因发热,肌肉痛,乏力,头痛等类似病毒感染性疾病症状,临床缺乏对该病的足够认识,也缺乏相应的快速诊断方法,因此该病及易发生误诊,严重时可导致多器官功能衰竭,甚至死亡,所以对该病的确诊就要结合实验室检测进行诊断,目前应用于实验室检测方法主要有IFA、急性期的血液涂片检查、巢氏PCR、直接对病原的分离培养。但是免疫荧光方法(IFA)不仅需要特殊仪器如荧光显微镜,还需要等到恢复期采集第二次血液标本。病原体分离培养诊断十分可靠,但分离率低且耗时。以PCR为基础的分子生物学技术可以取代分离培养进行病原体检测,但需要特殊的仪器及具备一定实验室经验的人员才能完成。因此开发一种简便的灵敏性的高特异性的检测方法对于该病原体的诊断是很有必要的。
　　嗜吞噬细胞无形体的OMP1/MSP2/P44蛋白超家族是无形体的特征性的蛋白家族,该家族基因包含3个OMP1、1个msp2、2个msp2同源基因、1个msp4、113个p44 loci基因,可以作为诊断该病原的选择依据。本实验选取了 msp2及msp4两个主要表面蛋白作为研究的对象,对E-msp2、N-msp4、Z-msp4三个主要表面蛋白的全长基因进行原核表达,分别构建了pET32a、pET28a、pGEX-4T-1三个原核表达载体,诱导表达结果发现三个全长序列均未能在原核系统中进行表达,通过查阅文献显示可能与信号肽的存在有关联;进而对三个全长序列进行信号肽的分析,结果显示在三个全长的序列的N端都存在信号肽序列,信号肽序列影响其原核表达。
　　通过对三个全长序列的生物信息学的分析,在去除信号肽的前提基础上,选取了富含抗原表位区的序列,进行PCR扩增和原核表达载体的构建,并在原核细胞中成功表达目的蛋白,证明信号肽序列影响了全长序列在原核中的表达。在pET32a原核表达载体诱导表达后,三个蛋白的主要表达的形式是包涵体形式,通过亲和层析方法对表达的蛋白进行纯化,经WB验证三个重组蛋白的免疫原性。
　　利用原核表达的重组蛋白建立了ELISA检测方法,抗原在4℃过夜条件下包被,包被浓度为100μg/mL,待检血清稀释倍数为1:200,5％的脱脂奶粉37℃封闭1h,酶标二抗的最佳工作浓度为1:5000,底物显色10min,利用重组蛋白与羊布鲁氏菌、羊莱姆病阳性血清及大肠杆菌BL21血清均不发生交叉反应;批内和批间重复性试验变异系数都总之,本实验通过信号肽分析证实了在msp2、msp4蛋白的全长序列中信号肽的存在,并且影响其在原核中的表达。在去除信号肽序列基础上,通过大肠杆菌表达嗜吞噬细胞无形体主要的表面蛋白,获取纯化的重组蛋白,建立嗜吞噬细胞无形体血清学ELISA检测方法,该方法能够有效检出临床血清样本,为嗜吞噬细胞无形体的诊断提供了技术支持。

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英文缩略词表

第一篇 综述

1 病原分类学

2 病原及基因组特点

3 嗜吞噬细胞无形体的入侵机制

4 传播媒介及宿主动物

5 流行病学

6 临床症状及治疗

7 诊断和实验室检测

8 P44/msp2蛋白

第二篇 实验研究实验一 msp2、msp4蛋白全长中信号肽对原核表达的影响

1 材料和方法

2实验结果

3 讨论

实验二 嗜吞噬细胞无形体msp2、msp4蛋白的生物信息学分析及表达纯化

1 方法和材料

2 结果

3 讨论

实验三 重组msp2、msp4蛋白的免疫原性研究

1材料和方法

2 结果

3 讨论

第三篇 实验结论

参考文献

附件

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