聚多糖脱乙酰酶基因家族VdpdaAs在大丽轮枝菌中的功能分析

摘要

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)能够在多种植物包括棉花上引起萎蔫病害，对农业生产造成巨大的危害。但是由于棉花黄萎病属于土传维管束病害，病原菌传播途径多，存活时间长、生理小种变异多，抗病育种工作也相对滞后，所以棉花黄萎病的防治难度很大，至今还没有有效的防治措施。因此，本课题组利用农杆菌介导的转化和同源重组等一系列分子生物学技术，对大丽轮枝菌中的功能基因进行深入研究。本研究在轮枝菌中发现一个聚多糖脱乙酰酶基因VdpdaA，通过在大丽轮枝菌基因组库中查找发现，该基因家族存在三个基因，依次命名为VdpdaA1、VdpdaA2和VdpdaA3，对该基因家族功能分析得知：该家族基因在大丽轮枝菌的生长、产孢形成、菌丝生长和致病性过程中起着重要的作用。
　　本研究主要内容包括：⑴从已构建的落叶型强致病力菌株V592的突变体库中筛选到一株黑色微菌核产生受阻、致病性下降的突变体J105。利用Southern杂交技术对筛选到的突变体进行初步研究发现，T-DNA在该株突变体中属于单拷贝插入，利用TAIL-PCR等技术对该突变体进一步研究发现，一个编码聚多糖脱乙酰酶的（polysaccharide deacetylase family protein gen）基因VdpdaA1（VDAG-07142）的突变导致了突变体J105致病性显著下降，黑色微菌核产生受阻。⑵通过在大丽轮枝菌基因组库中查找发现，该基因还同时存在着另外两个同源基因，分别是VDAG-07727和VDAG-09706，三个基因均属于一个基因家族，在本研究中，这三个基因被依次命名为VdpdaA1、VdpdaA2和VdpdaA3。以pRF-HU2载体为基本骨架，成功构建了VdpdaA1、VdpdaA2和VdpdaA3的同源重组敲除载体。通过农杆菌介导的转化法（ATMT）转化大丽轮枝菌、DNA及RNA的杂交验证，每个基因分别得到2株敲除突变体△VdpdaA1-a、△VdpdaA1-b；△VdpdaA2-a、△VdpdaA2-b；△VdpdaA3-a和△VdpdaA3-b。⑶敲除突变体△VdpdaA1、△VdpdaA2、△VdpdaA3在PDA培养基上的表型均为菌核型，在培养基的正面和背面都产生黑色的微菌核。三个基因的敲除突变体在产孢量方面都明显下降，敲除突变体△VdpdaA1的致病性明显下降且分生孢子梗减少严重。qRT-PCR结果显示，这三个基因在野生型菌株V592中均具有组织表达特异性。以上结果显示，这三个同源家族基因在大丽轮枝菌的致病性、微菌核形成和产孢形成过程中起着重要的作用。

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缩略表

第一章 文献综述

1.1棉花黄萎病及其致病真菌大丽轮枝菌概述

1.2大丽轮枝菌致病机理的研究

1.3大丽轮枝菌功能基因研究进展

1.4真菌中几丁质代谢相关的几丁质合成酶和聚多糖脱乙酰化酶

1.5本研究的目的和意义

第二章 棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库的筛选及VdpdaA家族基因的确定

2.1材料和方法

2.2结果与分析

2.3结论与讨论

第三章 聚多糖脱乙酰酶家族基因VdpdaAs在大丽轮枝菌中的功能分析

3.1材料和方法

3.2结果与分析

3.3结论与讨论

参考文献

附录1 常用试剂及培养基的配置

附录2 本试验中所涉及到的引物

致谢

作者简介

石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表