陆地棉FLOWERING LOCUST同源基因GhFT1的克隆及功能分析

摘要

开花具有重要的生理意义，是显花植物能够成功生殖的关键条件。其中编码磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein,PEBP)的FLOWERING LOCUS T(FT)基因在营养生长向生殖生长转变过程中起着重要作用。FT基因在叶片中表达并翻译成蛋白后，经韧皮部进行长距离运输至顶端分生组织，与FLOWERING LOCUSD(FD)蛋白形成复合物，促进下游花身份相关基因APETALA1(AP1),LEAFY(LFY),SUPPERSSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1(SOC1)，FRUITFULL(FUL)等的表达，促使植物早花。
　　目的：对棉花成花素基因GhFT1进一步克隆和功能分析，明确GhFT1基因在棉花中的表达模式，对不同倍性的棉花FT基因进行多态性分析，为深入研究GhFT1基因功能奠定基础。
　　方法：基因克隆采用RT-PCR结合RACE技术，基因全长克隆采用PCR技术；基因表达分析采用半定量RT-PCR和quantitative Real-time PCR(qRT-PCR)技术；构建植物表达载体35S::GhFT1、35S::GhFT1-GFP，并通过浸花法转化拟南芥，将35S::GhFT1转化突变体 ft-10。将转化35S::GhFT1-GFP拟南芥幼苗用20％的蔗糖处理后进行激光共聚焦亚细胞定位分析。
　　结果：⑴将本实验室前期克隆的棉花成花素基因GhFTL1进行重新克隆，在本研究中该基因命名为GhFT1。首次扩增出GhFT1基因5′非编码区，将扩增的序列与本实验室前期得到序列进行拼接发现GhFT1基因的cDNA全长为818 bp，编码174个氨基酸。GhFT1基因由4个外显子和3个内含子构成，全长为3151 bp。氨基酸比对分析表明GhFT1蛋白具有保守的PEBP家族保守基序、2个保守的关键氨基酸络氨酸(Y)和谷氨酰胺(Q)、以及 FT家族中促进开花的保守片段 B。系统进化分析说明GhFT1与可可的TcPEBP蛋白亲缘关系近，属于FT-like亚家族成员。⑵GhFT1在棉花的不同组织中均有表达，在花器官、茎和叶片中的表达量要高于其他组织；GhFT1在棉花纤维起始期和延长期表达量逐渐升高；GhFT1随着棉花的生长发育表达量逐渐升高；GhFT1基因在长短日照条件下，表现出现昼夜节律表达模式。⑶四倍体陆地棉、二倍体雷蒙德氏棉和亚洲棉的FT基因都是由4个外显子和3个内含子构成，其中四倍体陆地棉和二倍体雷蒙德氏棉的氨基酸序列相同，同亚洲棉只有一个氨基酸不同。陆地棉FT基因相对拷贝数为4，雷蒙德氏棉与亚洲棉的FT基因相对拷贝数为2。⑷成功构建了GhFT1基因的原核表达载体，目的基因能够在大肠杆菌中大量表达融合蛋白，并以包涵体和可溶蛋白的形式存在。ELISA检测表明抗体血清与纯化的GhFT1重组蛋白有良好的免疫反应性。⑸拟南芥中异位过量表达GhFT1基因在长日照和短日照条件下均可促进拟南芥开花。qRT-PCR分析表明发现在拟南芥中过表达GhFT1可促进拟南芥花身份基因AP1，LFY，SOC1，FUL的表达。GhFT1可部分互补突变体ft-10的晚花表型，使突变体的开花时间提前。⑹GhFT1蛋白定位在细胞质和细胞核中，35S::GhFT1-GFP融合表达载体在拟南芥中过表达同样可使拟南芥出现早花表型。
　　结论：GhFT1是陆地棉FT的同源基因，由4个外显子和3个内含子构成，该基因开放阅读框为525 bp，编码174个氨基酸。在二倍体棉花中有2个拷贝，而在四倍体棉花中则有4个拷贝。GhFT1在棉花各组织中均有表达，可响应光周期表现出昼夜节律的表达变化。GhFT1-GFP融合蛋白主要定位在细胞质和细胞核中。在拟南芥中异位过量表达GhFT1基因会促进转基因拟南芥开花，在突变体ft-10中过量表达可部分互补晚花表型。

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引言

第一章 文献综述

1.1 FT促进开花的分子机制

1.2 FT同源基因促进植物开花

1.3 FT同源基因的其他功能

1.4 本课题的研究意义

第二章 棉花成花素基因GhFT1的全长克隆

2.1 材料和试剂

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

第三章 棉花GhFT1基因的表达分析

3.1 材料和试剂

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

第四章 棉花FT同源基因的多态性分析

4.1 材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

第五章 GhFT1基因的原核表达分析

5.1 主要试剂与菌种

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

第六章 棉花GhFT1的功能分析

6.1 材料与方法

6.2 实验方法

6.3 结果与分析

第七章 讨论与结论

7.1 讨论

7.2 结论

参考文献

致谢

作者简介

石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表