酵母蛋白酶制剂的研究

摘要

本论文以新疆天然发酵源酵母菌做为原始菌株，采用纯培养及诱变技术，筛选分离高产蛋白酶的酵母菌，在单因素的基础上进行高产蛋白酶菌株产酶条件的优化，并用硫酸铵沉淀法分离提纯蛋白酶。以壳聚糖为原料，对壳聚糖微球的制备条件及其性质、蛋白酶的固定化条件、固定化蛋白酶的酶学性质及乙醇、乙二醇、亚硫酸氢钠、氯化钠、尿素和蔗糖试剂对固定化蛋白酶活性的影响进行了研究。研究结果：
　　1、原始菌株通过纯培养、紫外诱变和紫外氯化锂复合诱变，选育的突变菌株为高产蛋白酶，该突变菌株相对于原始菌株酶活力提高了68.49U?mL-1。遗传稳定性研究表明，突变菌株经过5次传代培养酶活力均保持在100U?mL-1左右，该突变菌株具有良好的遗传稳定性。
　　2、突变菌株最优产酶条件为：甘油2％，蛋白胨1.5%，硫酸钙0.025%，Ga+对产酶也有激活作用。酶学性质初步发现酶最适作用温度为60℃，最适pH为10。
　　3、对蛋白酶提取工艺进行了初步研究，即发酵液经过离心，在上清液中添加硫酸铵至50%饱和度去除杂蛋白，然后在上清液中补加硫酸铵至70%饱和度沉淀得到目的蛋白，最后进行真空冷冻干燥得到中性蛋白酶粗品。其纯化倍数是3.34，蛋白酶的活力回收率61.34%。
　　4、制备微球最优工艺为：壳聚糖酸性溶胶浓度为2.5%、NaOH-乙醇为1：1、搅拌时间为80min、戊二醛添加量为1.5mL、乙酸乙酯添加量为7.5mL。在此条件下制备的壳聚糖微球具有吸附性能好、溶胀度好、形态大小均一、耐酸碱性较强等优良性状，能适用于较高温度的处理过程中而不会发生降解。
　　5、采用吸附-交联法固定蛋白酶，分别研究戊二醛浓度、交联时间、吸附时间对固定化酶影响，寻找最优固定化因素。试验结果表明：4%的戊二醛浓度交联3h、吸附15h下能较好的固定化蛋白酶。
　　6、对固定化蛋白酶的酶学性质进行研究。结果表明：固定化蛋白酶的最适 pH为10，与游离酶比向酸性方向偏移了一个单位；最适温度为70℃，比游离酶提高了10℃。与游离酶相比，固定化蛋白酶的酸碱稳定性、热稳定性均有明显的提高，有利于提高蛋白酶的利用率，进行工业化生产。
　　7、不同试剂对蛋白酶活性的影响。试验结果表明：乙醇溶液、乙二醇溶液、亚硫酸氢钠溶液、氯化钠溶液对两种酶都表现出抑制作用，对游离酶的作用较大。尿素溶液和蔗糖试剂是两种酶都有较大激活作用。由此可以看出，固定化蛋白酶对上述试剂浓度的变化的敏感性均不及游离酶。

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第一章 文章综述

1.1微生物蛋白酶简介

1.2主要产蛋白酶的酵母菌

1.3蛋白酶分类

1.4高产蛋白酶菌株的选育

1.5蛋白酶的酶制剂研究

1.6蛋白酶的纯化方法

1.7酶固定化方法

1.8壳聚糖在固定化酶中的应用

1.9酵母蛋白酶制剂应用

1.10研究目的及意义

第二章 高产蛋白酶酵母菌诱变选育

2.1材料与方法

2.2试验方法

2.3结果与分析

2.4结论

第三章 蛋白酶的提取

3.1材料与方法

3.2试验方法

3.3结果与分析

3.4结论

第四章 壳聚糖微球制备及工艺处方优化研究

4.1材料与方法

4.2试验方法

4.3结果与分析

4.4结论

第五章 蛋白酶固定化条件优化

5.1 材料与方法

5.2 试验方法

5.3结果与分析

5.4结论

第六章 结论与展望

6.1高产蛋白酶酵母菌诱变选育

6.2壳聚糖微球的制备

6.3蛋白酶固定化条件的确定

6.4创新点

6.5展望

参考文献

致谢

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