沙漠小球藻转人乳铁蛋白表达系统的优化

摘要

目的:构建人乳铁蛋白的沙漠小球藻 GTD8A1表达系统，以获得转基因藻种GTD8A1-HLF；优化植物表达载体的电转化条件(电压、培养周期、渗透剂浓度、质粒浓度、渗透处理时间、电击缓冲液浓度)，以增加阳性克隆率和细胞成活率；优化产物条件(pH、C、N、P、NaCl、Mg、Fe、Zn、B和Cu)，以提高转基因藻种GTD8A1-HLF表达人乳铁蛋白含量。为人乳铁蛋白的产业化和商业化提供上游试验藻种和生产工艺条件。
　　方法:(1)构建pCAMBIA2300-35S-GFP-HLF-OCS表达载体，以人乳铁蛋白基因作为电转优化的参考基因，首先采用单因素试验确定转染的转化条件，然后进行电转化正交试验，得到最优的电转化条件。
　　(2)构建pCAMBIA2300-35S-HLF-OCS表达质粒载体，将重组质粒电击转入沙漠小球藻GTD8A1细胞中，通过SDS-PAGE和Western Blot对蛋白进行分析，从而获得转基因藻种GTD8A1-HLF。
　　(3)通过单因素试验确定 Plackett-Burman(PB)试验的上下限，然后进行 Central Composite Design(CCD)试验，通过RT-PCR和ELISA技术测定在不同培养条件下转基因藻种GTD8A1-HLF的人乳铁蛋白含量，从而获得最适培养条件。
　　结果与结论:
　　1.通过电转优化试验结果表明：最优电转化条件是电压1400V、培养周期8天、渗透剂浓度0.2mol/L、渗透时间为0小时、质粒浓度为6?g/mL、电击缓冲液浓度为0.4mol/L，其细胞致死百分率为51.30％、荧光百分率为52.54%、PCR阳性平均百分率为42.30%。
　　2.试验结果表明：将人乳铁蛋白基因(HLF)电转进入到沙漠小球藻细胞中，通过菌落PCR鉴定后并在相同抗性的液体培养基中扩大培养，基因组DNA和RNA水平分析人乳铁蛋白基因的整合和转录，SDS-PAGE和Western Blot分析获得70kDa的目的蛋白；结果表明人乳铁蛋白的沙漠小球藻表达系统构建成功。
　　3.通过产物优化试验结果表明：最适培养条件为 NaCO3浓度为0.1mol/L、K2HPO4浓度为0.02mol/L、NaCl浓度为0.01mol/L、MgSO4浓度为0.03mol/L、CuSO4浓度为0.002mol/L、H3BO3浓度为0.02mol/L、NaNO3浓度为0.6mol/L、FeSO4浓度为0.006mol/L、ZnSO4浓度为0.002mol/L时，人乳铁蛋白的产量达到51.65 mg/L。

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前言

第一章 文献综述

1.1微藻研究现状

1.2小球藻转基因的研究

1.3乳铁蛋白的研究

1.4微藻电转化的研究进展

1.5微藻生长环境因素的研究进展

1.6研究目的和意义及主要内容

1.7技术路线

第二章 沙漠小球藻转人乳铁蛋白的电转优化研究

2.1试验材料和仪器

2.2试验方法

2.3结果与分析

2.3 讨论

第三章 人乳铁蛋白的沙漠小球藻表达系统的构建与鉴定

3.1材料与方法

3.2结果与分析

3.3讨论

第四章 不同培养条件对沙漠小球藻产人乳铁蛋白的影响

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3讨论

第五章 结论与展望

5.1结论

5.2 特色与创新之处

5.3展望

参考文献

致谢

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附表1. 正交试验结果统计表