miR-2459调控锌指抗病毒蛋白ZAP的表达对BVDV复制的影响研究

摘要

至今为止，有关BVDV导致易感动物感染方面的分子机制还不十分明确，BVDV与被感染宿主的细胞之间存在何种相互关联的机理仍处于探究阶段。故本实验室在前期的研究中使用solexa高通量测序检测了BVDV感染靶细胞 MDBK后的miRNA表达谱，结果显示：感染BVDV的MDBK细胞中miR-2459的表达量显著性升高。通过生物信息学预测软件分析发现miR-2459靶向于锌指抗病毒蛋白基因 ZAP。在此基础上，本实验研究以 miR-2459为研究对象，探究miR-2459如何影响BVDV复制？ZAP在其中发挥何种作用？进而为阐述 BVDV的持续性感染和 BVDV防控新方法奠定了理论基础。
　　目的:为探究miR-2459促进BVDV复制的分子机制。对实验室BVDV感染的MDBK细胞高通量测序的结果进行了分析，选取了表达量显著性上调的miR-2459来进行后续的研究。
　　方法:⑴BVDV感染MDBK细胞短期后，使用Stem-loop RT-PCR的方法鉴定细胞中miR-2459的表达水平；转染 miR-2459模拟物和抑制剂，RT-PCR和Reed-Münch法检测BVDV的复制水平。⑵生物信息学软件预测 miR-2459的靶基因；双荧光素酶报告基因实验鉴定 miR-2459能直接靶向于ZAP3’UTR区域；转染miR-2459模拟物和抑制剂，RT-PCR检测miR-2459对ZAP表达的影响；RT-PCR检测BVDV NADL侵染MDBK细胞后靶细胞中ZAP的表达水平。⑶构建ZAP的过表达载体pLEX–EGFP-ZAP；在HEK-293细胞上采用钙转的方式包被慢病毒；使用慢病毒侵染MDBK细胞，使用嘌呤霉素在细胞的传代中对细胞不断的筛选，以期获得稳定过表达ZAP的MDBK细胞系；BVDV感染过表达ZAP的MDBK细胞后，RT-PCR和Reed-Münch法测定miR-2459对BVDV复制水平的影响。
　　结果:⑴Stem-loop RT-PCR的方法鉴定得到，BVDV感染MDBK细胞短时间内，细胞内miR-2459的表达水平呈上升趋势； MDBK细胞中转染miR-2459模拟物和抑制剂后，再感染BVDV病毒后， miR-2459对BVDV复制起促进作用。⑵使用生物信息学软件预测到miR-2459的靶基因是抗病毒相关的锌指抗病毒蛋白基因ZAP；双荧光素酶报告基因实验鉴定出miR-2459直接靶向于ZAP的3’ UTR区；分别转染miR-2459的模拟物和抑制剂后，miR-2459对ZAP mRNA的表达有抑制作用；BVDV NADL侵染的靶细胞中，ZAP mRNA水平呈下降趋势。⑶成功构建出ZAP过表达载体pLEX–EGFP-ZAP；成功包被出慢病毒并获得了稳定过表达ZAP的MDBK细胞系；RT-PCR和Reed-Münch法检测发现过表达ZAP的MDBK细胞对BVDV的复制有极显著地抑制作用。
　　结论: miR-2459直接靶向于锌指蛋白ZAP的3’UTR区域，并影响ZAP的表达水平，从而间接抑制细胞的抗病毒作用，在BVDV的复制过程中发挥促进的作用。

目录

声明

英文缩略表

引言

第一章文献综述

综述一 牛病毒性腹泻病毒的基本概况

1.BVDV基因结构及其编码的蛋白

2．BVDV持续性感染及免疫抑制

3 .BVDV的诊断及防治现状

4.小结与展望

综述二 miRNA对病毒调控作用的研究进展

1 miRNA概述

2．miRNA的调控机制

3. MiRNA与病毒感染之间的联系及应用

4.小结与展望

综述三 锌指蛋白的抗病毒作用研究进展

1.锌指蛋白的发现及作用

2.锌指蛋白抗病毒机理

3.锌指蛋白未来研究方向

第二章 实验研究

实验一 miR-2459对BVDV 复制水平影响的研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

实验二miR-2459 对锌指抗病毒蛋白ZAP表达的影响的研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

实验三 牛锌指蛋白ZAP过表达慢病毒载体构建及其过表达细胞株的鉴定

1.材料与方法

2. 结果与分析

3 讨论

4.小结

结论

创新点

参考文献

致谢

作 者 简 介

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