汉坦病毒S基因在大肠埃希菌中的克隆和表达

摘要

目的：汉坦病毒(Hantavirus，HV)是肾综合征出血热(HemorrhagicFeverwithRenalSyndrome，HFRS)的病原体，可导致人类两种疾病：HFRS和汉坦病毒肺综合症(HantavirusPulmonarySyndrom，HPS)。HV核蛋白(NucleocapsidProtein，NP)是其主要的结构蛋白之一，本文旨在对编码NP蛋白的S基因在大肠埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)BL21(DE3)中进行克隆和表达，并对表达产物进行鉴定。 方法：以pGEM-T-L99S和pGEM-T-Z10S为模板，分别经PCR扩增L99S和Z10S的ORF，前者经EcoRⅠ及XhoⅠ双酶切，后者经SacⅠ及XhoⅠ双酶切，纯化后将二者与经相同双酶切所得的pET32a和pET28a载体大片段相连接，转入E.coliTop10感受态细胞中；在抗生素(pET32a为氨苄青霉素抗性，pET28a为卡那霉素抗性)筛选下，挑取阳性重组子。经微量碱裂解法提取重组质粒，以PCR法、酶切法和序列分析法进行鉴定。继而将正确定向克隆的重组质粒转入表达宿主Ecoli.BL21(DE3)感受态中，通过IPTG对重组菌进行NP蛋白的诱导表达，并使用HFRS患者阳性血清进行WesternBlot鉴定。同时，摸索不同浓度的IPTG和不同诱导时间对重组菌中目的蛋白产量的影响。 结果：PCR扩增获得的L99S基因和Z10S基因定向克隆入pET32a和pET28a后，挑取抗性筛选的阳性重组子，分别择其一命名为：pET32a-L99S、pET32a-Z10S、pET28a-L99S和pET28a-Z10S。PCR法、酶切法和序列分析对上述重组质粒鉴定结果显示，L99S基因和Z10S基因已经正确连接入pET32a和pET28a载体，且未改变读码框架。将上述重组质粒转化入Ecoli.BL21(DE3)感受态中，挑取阳性重组菌分别命名为E.coliBL21(DE3)/pET32a-L99S、E.coliBL21(DE3)/pET32a-Z10S、E.coliBL21(DE3)/pET28a-L99S和E.coliBL21(DE3)/pET28a-Z10S。IPTG诱导重组菌E.coliBL21(DE3)/pET32a-L99S和E.coliBL21(DE3)/pET32a-Z10S，结果显示重组蛋白表达量达菌体总蛋白的40％；IPTG诱导重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-L99S和E.coliBL21(DE3)/pET28a-Z10S，结果显示重组蛋白表达量明显低于前两者，分别占菌体总蛋白的32％和27％。此外，经pET32a构建的重组蛋白除包涵体表达外还有部分蛋白以可溶性形式存在；而经pET28a构建的重组蛋白主要以包涵体形式存在，未见上清中存在目的蛋白。我们对表达条件进行优化，结果显示：经pET32a构建的重组蛋白表达量受诱导剂浓度及诱导时间的双重影响，L99S和Z10S重组蛋白分别经0.5mmoL、1.0mmoLIPTG诱导5h，表达量最高；经pET28a构建的重组蛋白表达量不随诱导时间延长而增高，但在0.5mmoLIPTG时表达量达最高。以上两组重组蛋白均可与HFRS患者阳性血清反应。 结论：该研究成功构建了汉坦病毒L99株与Z10株S基因的原核表达系统，获得了重组蛋白的初步表达，并对表达条件进行优化，便于后期大量表达及纯化工作的进行，为HFRS诊断试剂的开发和防治工作奠定了基础。

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