大肠埃希菌质粒AmpC酶和ESBLs的基因型及耐药性研究

摘要

目的：大肠埃希菌是引起临床感染尤其是医院内感染最常见的革兰阴性杆菌之一。其对抗菌药物的耐药机制非常复杂，对三代头孢菌素的耐药主要是由于产生超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和质粒AmpCβ-内酰胺酶。当一株细菌同时产这两种酶时，预示着其具有更强的耐药性。本课题选取天津地区两家三级甲等医院临床分离的大肠埃希菌作为研究对象，分析其对常见抗菌药物的耐药性，研究质粒介导的AmpC酶和ESBLs的流行情况及基因型分布，为正确掌握细菌耐药的发展趋势、临床合理应用抗生素及延缓和控制耐药基因的播散提供理论依据。 方法：选取2006年3月～12月天津市两家三级甲等综合医院临床分离的大肠埃希菌作为受试菌，依据医院感染诊断标准将其区分为医院感染和社区感染菌；分别采用K-B法及微量肉汤稀释法对所有菌株进行药敏试验，并比较其对不同抗菌药物的耐药性；采用ESBLs初筛及纸片确认试验检测产ESBLs菌株，并分析产酶菌与非产酶菌的耐药情况；采用三维试验检测产AmpC酶菌株；对三维试验阳性的菌株，扩增质粒AmpC酶基因以确定其基因型；进行质粒接合试验以定位耐药酶基因，并采用K-B法对供体菌及接合子进行药敏试验；对质粒AmpC酶基因扩增及质粒接合试验阳性同时合并ESBLs阳性的菌株，再进行ESBL基因的PCR扩增以确定其基因型；将部分同时产质粒AmpC酶和ESBLs菌株的PCR产物进行测序，将测序结果在GenBank上行同源性分析。 结果：1.自2006年3月～12月天津市两家医院共分离大肠埃希菌203株，其中医院内感染菌株占19.7％。药敏结果示：受试菌对亚胺培南最为敏感，耐药率仅为0.5％；对头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、头孢西丁及阿米卡星敏感性也较好，耐药率在10％～20％之间；对头孢唑啉、头孢呋辛、哌拉西林、庆大霉素、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星的耐药率均高于60％。其中医院感染菌的耐药率明显高于社区感染菌。2.ESBLs纸片确认试验阳性菌55株，检出率为27.1％，其中医院感染菌株的ESBLs阳性率为62.5％，明显高于社区感染菌株(P<0.05)。产ESBLs菌株对抗菌药物的耐药率高于非产ESBLs菌株；产ESBLs菌株对头孢噻肟的耐药率明显高于头孢他啶。AmpC酶三维试验阳性菌12株，检出率为5.9％，其中医院感染菌株的AmpC酶表型检测阳性率为10.0％，高于社区感染菌，但差异无统计学意义(P>0.05)。AmpC酶及ESBLs同时阳性者为7株，检出率为3.4％。3.对12株AmpC酶三维试验阳性菌株行质粒AmpC酶基因的PCR扩增，8株扩增阳性，其中6株(E59，E85，E134，E168，E184，E200)扩增出CIT型462bp的目的片段，2株(E112，E220)扩增出DHA型405bp的片段。对此8株菌进行质粒接合试验，所有菌株均接合成功。药敏结果示：供体菌几乎对三代头孢、庆大霉素及喹诺酮类药物全部耐药，对头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦及阿米卡星也显示了不同程度的耐药，仅对亚胺培南全部敏感；供体菌将对β-内酰胺类的耐药性成功传递给了受体菌，但药敏结果显示部分接合子对头孢吡肟及头孢哌酮/舒巴坦的耐药性与供体菌相比有所下降，且2株接合子出现了对氨基糖甙类的耐药。4.在8株质粒接合试验阳性菌株中，3株同时合并ESBLs表型检测阳性。对此3株菌进行ESBLs基因的PCR扩增：1株(E59)同时产TEM型和CTX-M-3组型目的片段，1株(E112)同时产TEM型和CTX-M-14组型目的片段，1株(E220)同时产TEM型、CTX-M-3组型和CTX-M-14组型目的片段。对部分PCR产物进行测序分析，结果示：E59菌株CIT型基因与CMY-2型AmpC酶100％同源；E220菌株DHA型基因与DHA-1型AmpC酶、TEM型基因与TEM-1型β-内酰胺酶、CTX-M-3组型基因与CTX-M-55型ESBLs、CTX-M-14组型基因与CTX-M-19型ESBLs100％同源。 结论：天津地区两家医院大肠埃希菌对临床常用抗菌药物的耐药性略高于2005年的国内平均水平，其ESBLs和AmpC酶检测阳性率均略低于国内其它地区的报道。本研究首次报道了天津地区大肠埃希菌质粒AmpC酶的基因型分布，该结果与国外的报道相似，但与国内大部分地区的报道不一致，说明AmpC酶的基因型分布存在地域性差异。本研究检出了3株质粒AmpC酶基因和ESBLs基因扩增同时阳性的大肠埃希菌，其中1株的基因型组合(DHA-1型AmpC酶、TEM-1型β-内酰胺酶、CTX-M-19型及CTX-M-55型ESBLs)此前尚未见报道。

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综述 超广谱AmpC酶的研究进展

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