Twist诱导上皮间充质转变在肝细胞癌血管生成中的作用

摘要

目的：研究肝细胞癌(HCC)中是否存在血管生成拟态(VM)，探讨Twist诱导上皮间充质转变(EMT)在HCC血管生成中的作用，揭示HCC血管生成的可能分子机制。 方法：应用CD31和PAS双重染色及Hepatocyte免疫组化染色方法检测102例福尔马林固定、石蜡包埋肝细胞癌组织中是否存在血管生成拟态；免疫组织化学方法检测Twist、E-cadherin、β-catenin、Vimentin、MMP-9和MMP-2在有VM组与无VM组HCC中的表达，通过CD31免疫组化染色计数微血管密度(MVD)。 结果：一、HCC中存在血管生成拟态：1.HE染色结果观察到19例肝癌组织中存在由肝癌细胞围成的管腔样结构，该管腔无内皮细胞衬附，管腔内可见红细胞，而管腔周围未见坏死的肝癌细胞，也未见到出血及炎细胞浸润；还观察到这种管腔样结构主要存在于分化差、恶性度高的实体型及低分化型的HCC中，提示这种结构与HCC恶性生物学行为相关。2.CD31/PAS双重染色及Hepatocyte免疫组化染色结果CD31为内皮细胞特异标记物，而Hepatocyte为肝癌细胞特异标记物，因此为了证实HE切片中观察到的管腔样结构为血管生成拟态，本文进行了CD31与PAS双重染色及Hepatocyte免疫组化染色。显微镜下观察显示：围成管腔样结构的细胞Hepatocyte染色阳性、CD31染色阴性，证实为肝癌细胞而不是内皮细胞，管腔内存在红细胞，一层PAS阳性物质围成环状结构将肿瘤细胞和红细胞分开，管腔内无坏死的肿瘤细胞及炎细胞，提示该管腔样结构不是由于肝癌细胞坏死形成的裂隙，而是由肝癌细胞通过自身塑型围成的类似血管的管道，而PAS阳性物质围成的环状结构就类似血管的基底膜，也即表明这种管道为VM；二、Twist及其相关蛋白免疫组化结果：1.Twist蛋白在HCC中的表达Twist弥漫表达于肝癌细胞的胞浆内，约有30％的病例阳性细胞聚集呈局部高表达，有的癌巢中呈局灶性强阳性表达：约有10％，尤其是低分化病例的肝癌细胞核内也存在Twist的表达，提示Twist的定位与表达与肝癌细胞的分化程度密切相关。存在VM的HCC组Twist阳性表达率高，为78.95％(15/19)，阳性强度亦高，其阳性强度积分平均为2.94；而不存在VM的HCC组中Twist的阳性表达率为42.17％(35/83)，其阳性强度积分平均为2.62；两组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，提示Twist作为一种转录因子在VM形成的信号转导过程中可能起重要作用。2.上皮细胞粘附分子E-cadherin、β-catenin在HCC中的表达E-cadherin主要表达于癌旁肝硬化组织的细胞膜上，呈现黄褐色颗粒状着色，均匀分布。肝癌组织中E-cadherin表达降低甚至缺失。存在VM的HCC组E-cadherin的表达明显降低，其阳性表达率为15.79％(3/19)，而不存在VM的HCC组E-cadherin的表达阳性率为48.19％(40/83)，两者相比差异具有统计学意义(P<0.05)，推测肝癌细胞之间粘附力的减弱可能是VM形成的一个重要因素。3.间叶标记蛋白Vimentin及基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9在HCG中的表达Vimentin阳性物质分布于肝癌组织的间质，主要位于肿瘤血管内皮细胞，而肝癌细胞均为阴性表达。Vimentin常特异性地表达于间叶细胞，但是上皮源性肿瘤在演进过程中，也可“反常”表达，这种现象与肿瘤细胞的恶性生物学行为密切相关，提示肝癌细胞的恶性生物学行为可能与Vimentin的表达无关。4.相关分析结果：Twist表达与E-cadherin表达呈负相关(r=-0.227，P<0.05)，而与MMP-9表达呈正相关(r=0.347，P<0.05)；三、Twist及其相关蛋白的表达与MVD的关系Twist高表达病例组MVD(20.48±13.52)大于低表达组(15.10±11.75)，差异具有统计学意义(P<0.05)；MMP-2高表达病例组MVD(18.42±12.01)大于低表达组(12.52±10.01)，差异具有统计学意义(P<0.05)；MMP-9高表达病例组MVD(20.08±13.36)大于低表达组(12.11±10.09)，差异具有统计学意义(P<0.05)；E-cadherin、β-catenin高表达组与低表达组之间MVD的差异没有统计学意义(P<0.05)，提示Twist、MMP-2和MMP-9可能促进HCC内皮依赖性血管的形成；四、Twist及其相关蛋白的表达与HCC临床病理参数的关系Twist、E-cadherin、β-catenin、MMP-2和MMP-9表达与HCC病人的年龄、性别、组织学类型、肿瘤大小以及Edmondson分级均不相关。Twist、E-cadherin、MMP-2和MMP-9的表达与HCC的临床分期及转移有关。Twist在临床分期为IIIIV期的肝癌组织中阳性率为60.71％(34/56)，与III期(阳性率为34.78％)相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；在转移组的阳性率为75％(27/36)，而无转移组的阳性率为34.85％(23/66)，两组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。E-cadherin在临床分期为IIIIV期的阳性率为32.14％(18/56)，而在III期的阳性率54.35％(25/46)，两组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。E-cadherin在转移组与无转移组的阳性率分别为27.78％(10/36)、50％(33/66)，两组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。MMP-2和MMP-9在转移组的阳性率分别为75％(27/36)、69.44％(25/36)，与无转移组(阳性率分别为42.12％、43.89％)相比都具有统计学意义(P<0.05)，表明Twist的高表达、E-cadherin低表达可能加速了肝癌细胞的浸润进展，MMP-2和MMP-9的高表达导致细胞外基质和基底膜的降解加速，从而使肝癌细胞易于移出癌巢和进出血管，形成新的转移灶。 结论：1)HCC中存在VM，VM是肿瘤细胞为适应环境而产生的一种独特的血液供应模式，与内皮依赖性血管并存于肿瘤组织内，其发生率为18.6％(19/102)，存在VM的HCC恶性度高，易转移，预后差。2)存在VM的HCC组中Twist和MMP-9阳性表达率均高于不存在VM的HCC组，而存在VM的HCC组中E-cadherin阳性表达率低于不存在VM的HCC组；相关分析表明Twist阳性表达与E-cadherin呈负相关关系，而与MMP-9呈正相关关系，提示Twist可能通过抑制E-cadherin的表达，上调MMP-9的表达促进HCC中VM的形成。MMP-9表达上调降解并重塑细胞外基质，为肝癌细胞形成VM创造了条件。3)MVD在Twist、MMP-9及MMP-2高表达组均大于低表达组；相关分析表明Twist阳性表达与MMP-9呈正相关关系、而与MMP-2无相关关系，提示Twist可能主要通过上调MMP-9的表达促进HCC血管生成，MMP-9通过降解细胞外基质和基底膜，促进HCC血管生成。4)Twist蛋白可能参与了HCC局部微循环的建立，其机制可能为Twist蛋白过表达诱导上皮间充质转变，使肝癌细胞E-cadherin表达下调，β-catenin异常表达，β-catenin进入细胞核启动MMP-9基因的转录。5)Twist蛋白可能通过诱导EMT，上调MMP-9的表达促进了HCC的局部微循环的建立，加速了肝癌细胞的恶性进展及转移。

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