嗜酸性粒细胞阳离子蛋白检测试剂盒的制备及其临床应用

摘要

目的:1.制备双抗夹心ELISA(enzymelinkedimmunosorbentassay，酶联免疫吸附试验)嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(eosinophiliacationicprotein，ECP)检测试剂盒。2.对不同的包被方法进行比较。3.评估ECP水平检测在过敏性疾病诊疗中的意义。 方法:1.双抗夹心ELISAECP检测试剂盒的制备：(1)葡萄球菌A蛋白亲和层析法纯化抗-ECP单克隆抗体(monoclonalantibody，mAb)，(2)过碘酸钠法HRP标记抗-ECP多克隆抗体(polyclonalantibody，pAb)，(3)ELISA试剂盒的制备与条件优化，(4)实验效能评价。 2.ECP检测试剂盒的方法学比较：(1)抗-ECPmAb的生物素化，(2)BSA的生物素化，(3)先包被生物素的ELISA试剂盒的制备与条件优化，(4)先包被亲和素的ELISA试剂盒的制备与条件优化，(5)比较三种检测方法。 3.评估ECP水平检测对过敏性疾病诊疗的意义：(1)评估采血方式对ECP结果的影响，(2)评估ECP检测对过敏性皮肤病诊疗的意义：检测过敏性皮肤病患者血清ECP水平；检测患者总IgE水平，并评估其与ECP的相关性；评估荨麻疹患者治疗前后ECP水平的变化，以及其ECP水平与症状评分、总IgE、特异性IgE相关性；评估异位性皮炎患者疾病症状评分与ECP水平、总IgE、嗜酸性粒细胞(EOS)计数的相关性。4.评估ECP水平检测在过敏性鼻炎诊疗中的意义。 结果:1.双抗夹心ELISAECP检测试剂盒的制备：(1)通过对该方法中各种反应条件的摸索和优化，确定了最适工作条件：单抗最适包被浓度1:500稀释，酶标多抗最适浓度为1:8000稀释，最佳封闭液为1％的BSA，最适血清稀释液为稀释液II，最佳反应时间为60min，反应温度为37℃。(2)本研究制备的试剂盒线性范围为2.5～200ng/ml，灵敏度为2.75ng/ml，相对偏差为11.5％，批内变异系数<10％，批间变异系数<15％，稳定性较好，与ADL试剂盒相比较相关系数为0.97。 2.三种方法的比较：(1)生物素亲和素包被法线性范围为2.5～500ng/ml，灵敏度为2.61n咖l，相对偏差为10.9％；(2)亲和素包被法线性范围为2.5～500ng/ml，灵敏度为2.68ng/ml，相对偏差为11.9％。(3)三种方法的重复性、精确性没有显著性差异，稳定性亲和素包被法最为稳定，抗体包被法次之，生物素包被法最不稳定，抗体直接包被法操作最为简易，但抗体用量最多。 3.ECP水平检测对过敏性疾病诊疗的意义：(1)标本采集后37℃放置1h的结果显著高于室温与0℃组，抗凝剂对ECP水平无影响，而标本溶血使ECP水平显著升高。(2)过敏性皮肤病患者血清ECP水平高于正常对照组(P<0.01)，总IgE水平高于正常值(P<0.05)，二者无相关性；荨麻疹患者治疗前后ECP水平有显著差异(P<0.05)，且ECP水平与症状评分、特异性IgE呈正相关；异位性皮炎患者疾病症状评分与ECP水平呈正相关，而与EOS，总IgE之间无相关性。 4.过敏性鼻炎患儿ECP水平高于正常对照组(P<0.01)，与特异性IgE呈正相关，而与总IgE之间无相关性。 结论:1.我们制备了具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点的性能良好的双抗夹心ELISAECP检测试剂盒。2.三种方法比较，生物素包被法的灵敏度、线性范围要好些，且具有抗体用量少的优点，但稳定性较差。3.ECP检测对过敏性疾病诊疗具有重要意义。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:符号说明

声明

前言

研究现状与成果

研究目的和方法

一 ECP检测试剂盒的制备

1对象与方法

2结果

3讨论

4小结

二 ECP检测试剂盒的方法学比较

1对象和方法

2结果

3讨论

4小结

三ECP与过敏性疾病的相关性研究及其应用

1对象与方法

2结果

3讨论

4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 嗜酸性阳离子蛋白在变态反应疾病中的应用及其检测

致谢