脂多糖对人牙周膜干细胞一氧化氮表达的影响

摘要

目的:
　　 研究人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)在脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)刺激下产生一氧化氮(Nitric oxide,NO)的能力及一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase,NOS),干扰素诱导蛋白10(IP-10)的表达情况,为探讨牙周膜干细胞在免疫调节中的作用机制提供前期研究基础。
　　 方法:
　　 收集临床上12-18岁因正畸拔除的健康无龋的前磨牙50例,刮取根中部的牙周膜,采用组织块直接贴壁培养法体外分离培养hPDLSCs,并进行牙周膜干细胞的鉴定。取对数生长期的4-8代细胞用于后续实验。实验分为对照组、LPS组(1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml、10000ng/ml)及L-单甲基精氨酸(NG-Monomethyl-L-arginine,Monoacetate Salt,L-NMMA)组(10ng/mlLPS+100μmol/L L-NMMA)。细胞在37℃、5％CO2培养3h、6h、12h、24h后硝酸还原酶法检测细胞培养上清液中NO含量,ELISA法检测细胞培养上清液中IP-10的表达；免疫组化检测刺激前后牙周膜干细胞iNOS、nNOS、eNOS的表达,RT-PCR检测细胞中iNOS mRNA的表达。
　　 结果:
　　 1.组织块法培养人牙周膜细胞成功率高,表达人牙周膜干细胞标志STRO-1和CD146,具有骨向和脂肪向等多向分化的潜能,具备干细胞的特性。
　　 2.不同浓度LPS处理hPDLSCs后,hPDLSCs产生的NO的浓度随时间增加而增加,在24h时达到高峰；hPDLSCs产生的NO的量随着LPS浓度升高而增加；加入L-NMMA可使NO产生浓度降低(P<0.05)。
　　 3.免疫组化显示,不同浓度LPS处理hPDLSCs后,iNOS的中度表达,主要表达在hPDLSCs胞浆中,而eNOS、nNOS在未处理组和处理组均见中等程度表达,无显著差异。L-NMMA和LPS共处理组仍表达iNOS。
　　 4.RT-PCR结果显示LPS刺激3h时iNOS mRNA增多。
　　 5.ELISA显示,不同浓度LPS处理hPDLSCs后,上清液中IP-10的含量随时间增加而增加,在48h时达到高峰,随着LPS浓度的增加而降低。
　　 结论:
　　 1.LPS作用下,hPDLSCs产生NO的能力在一定时间内逐渐增强。
　　 2.hPDLSCs产生NO主要是因为hPDLSCs中iNOS表达增多。
　　 3.L-NMMA不抑制iNOS mRNA的表达,但可能抑制iNOS的活性。
　　 4.LPS刺激hPDLSCs产生IP-10,含量随时间增加而增加。