VHL-/-肾细胞癌肿瘤形成过程中HIF2α靶基因作用研究

摘要

研究目的:
　　约70％的肾透明细胞癌存在VHL等位基因的失活、表达缺失（表现为基因突变、缺失及启动子甲基化等），表明VHL基因突变(VHL-/-)在肾细胞癌的形成过程中具有重要的作用。VHL基因蛋白产物(pVHL)可与HIF结合，使HIF泛素化被蛋白水解酶降解。VHL-/-肾细胞癌细胞系786-O由于VHL的表达缺失而导致细胞内HIF-2α大量累积，后者可进一步诱导百余种缺氧适应基因(HIF-2α下游靶基因)的表达。本研究的目的在于探讨VHL-/-肾细胞癌肿瘤形成过程中HIF-2α下游靶基因的作用，寻找潜在的治疗靶点，为肾细胞癌诊断、治疗及预后提供理论依据。
　　研究方法:
　　1.应用半定量QPCR技术在mRNA水平验证在786-O细胞(786-O VHL+/+，786-O VHL-/-,786-O HIF2α depleted[VHL-/-HIF566],786-O HIF2α depleted[VHL-/-HIF1631], VHL+/+ HIF2α-dPA[active], VHL+/+ HIF2α-PA-dTA[inactive])由单一的有活性的HIF-2α诱导表达升高的基因;
　　2.应用RNAi技术，慢病毒介导shRNA沉默特定HIF下游靶基因;
　　3.对稳定转染相应shRNA的细胞进行Western Blot，Real Time RCR或者Elisa验证其是否成功抑制该基因的表达;
　　4.体外增殖实验及裸鼠体内成瘤实验，研究特定HIF2α下游靶基因对VHL-/-肾细胞癌肿瘤形成的作用。
　　结果:
　　1.体内及体外实验证实HIF对VHL-/-的肾细胞癌成瘤十分重要。
　　2.在786-O细胞中，HIF转录活性紧密调控着VEGF，CCND1，ENO2，EglN3，ANGPTL4, Glut-1, IGFBP3, HIG2, CA12, MTUS1, ZNF395, CP, MXI-1,ARRDC3，Serpine1，Apol1，DDIT4，DUSP1等基因的表达。
　　3.抑制VEGF，CCND1的表达可以抑制VHL-/-肾细胞癌生长，提示它们是促癌基因;抑制ANGPTL4，EGLN3或ENO2的表达并不影响VHL-/-肾细胞癌生长;GLUT1或IGFBP3表达缺失明显促进VHL-/-肾细胞癌生长，提示它们有一定的抑瘤作用。
　　4.抑制IGF1R蛋白表达导致IGFBP3在mRNA和蛋白水平表达的显著增加，并抑制肿瘤生长，提示IGF1R是潜在的肾细胞癌治疗靶点。
　　结论:
　　1.HIF-2α对VHL-/-肾细胞癌成瘤至关重要，但HIF下游靶基因的表达对肾癌细胞生长的作用则可表现为促进、抑制亦或没有影响;通过对HIF-2α下游靶基因的研究可以发现潜在的VHL-/-肾细胞癌治疗靶点或诊断及预后指标。
　　2.沉默IGF1R能够抑制肾细胞癌细胞系786-O成瘤，提示IGF1R是潜在的肾细胞癌治疗靶点，其作用的发挥可能通过上调IGFBP-3而实现，为进一步明确VHL-HIF-HRGs调节肿瘤发生发展的机制提供了新的思路。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、验证VHL-HIF-HRGs通路及HIF对786-0细胞成瘤的重要性

1．1 对象和方法

1．1．1 实验对象

1．1．2 实验方法

1．2 结果

1．2．1 WB验证REN．01、REN．02、786-0细胞VHL-HIF-HRGs调节通路

1．2．2 HIF对VHL-／-786-0成瘤至关重要

1．3 讨论

1．4 小结

二、mRNA水平验证786-0细胞中HIF-2α诱导的基因

2．1 对象和方法

2．1．1 实验对象

2．1．2 实验方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

三、沉默特定HIF下游靶基因对VHL-／-肾细胞癌细胞系786-0体内成瘤能力的影响及其可能机制

3．1 对象和方法

3．1．1 实验对象

3．1．2 实验方法

3．2 结果

3．2．1 抑制HIF下游基因表达的786-0体外增殖实验

3．2．2 抑制HIF下游基因的786-0体内实验

3．3 讨论

3．3．1 干扰HRGs对786-0细胞体外增殖没有影响

3．3．2 VEGF对786-0细胞成瘤能力的影响

3．3．3 CCND1对786-0细胞成瘤能力的影响

3．3．4 ANGPTL4，EGLN3，ENO2对786-0细胞成瘤能力的影响

3．3．4 VHL-HIF通路与Glut-1

3．3．6 沉默IGFBP3及IGF1R对786-0细胞成瘤的影响及其机制

3．3．7 HIF-HRGs调节肾细胞癌生长示意图

3．4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述 肾细胞癌治疗进展综述

致谢