滑膜细胞微环境对软骨细胞生物学活性的影响

摘要

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种好发于中老年人的慢性进行性骨关节病。它是一种以软骨退行性变为核心，累及骨质，包括滑膜，关节囊及关节囊外其他结构的不同程度的炎性病变。随着我国人口老龄化和OA发病趋势年轻化，OA逐渐成为危害人类健康和生存质量的重要疾病。对OA发生和发展机制的研究也已成为骨科领域研究的重点。研究显示无论何种原因引发的OA多伴有关节内微环境失衡，滑膜及其细胞是其主要因素。
　　 目的：建立滑膜细胞与软骨细胞共培养体系，构筑类OA微环境，探讨滑膜细胞在OA发生中的作用，为OA发病机理研究提供依据。
　　 方法：⑴采用改良的Hulth法复制兔膝关节骨性关节炎模型，切除内侧半月板，切断内侧副韧带及前交叉韧带，术后4周关节肿胀、滑膜增生明显，获得大量滑膜组织。⑵用胰蛋白酶-Ⅱ型胶原酶联合酶消化法分离滑膜细胞进行原代与传代培养，观察滑膜细胞形态、活性，进行CD68免疫组化鉴定。⑶采用两步酶消化法从正常兔膝关节软骨组织获取软骨细胞，进行原代、传代培养及细胞学观察；⑷建立滑膜细胞与软骨细胞共培养体系，将原代和传代滑膜细胞分别以不同的比例(1:1，1:1/2，1:1/4，1:1/8)分别与软骨细胞(细胞数为4×104个)共培养，以正常软骨细胞组为对照组，观察原代及传代滑膜细胞微环境对软骨细胞形态及生物学活性的影响。⑸采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)方法检测共培养10天和20天时原代及传代滑膜细胞微环境对各组软骨细胞在RNA水平上，Ⅱ型胶原及蛋白多糖基因表达的影响。
　　 结果：①改良Hulth法复制膝骨性关节炎模型，造模4周关节肿胀，滑膜组织增生明显，衬覆滑膜细胞层数增加，间质纤维组织增生，软骨表面裂隙或纤维化，软骨细胞呈小灶性坏死。②胰蛋白酶-Ⅱ型胶原酶联合酶消化法可培养获得大量滑膜细胞且细胞活性大于98％，巨噬细胞样滑膜细胞CD68免疫组化染色阳性。③胰蛋白酶-Ⅰ型胶原酶-Ⅱ型胶原酶联合酶消化法可成功分离并获得大量高活性软骨细胞。④以滑膜细胞与软骨细胞共培养体系构筑了滑膜细胞微环境，滑膜细胞数量、培养时间与软骨细胞形态及增殖活性密切相关，滑膜细胞数量越多、作用时间越长，软骨细胞增殖活性越低。⑤滑膜细胞与软骨细胞共培养体系中，滑膜细胞数量、代次与Ⅱ型胶原及蛋白多糖基因表达密切相关。共培养的软骨细胞基因表达明显下调，原代滑膜细胞作用强于传代滑膜细胞；滑膜细胞数量越高，软骨细胞基因表达越低。
　　 结论：⑴改良Hulth造模法可迅速形成骨性关节炎，使滑膜组织在短时间内增生明显，衬覆滑膜细胞层数增加，间质纤维组织增生，获得大量的滑膜组织，解决了滑膜取材难的问题。该法适用于提取滑膜组织和OA发病机制的研究。⑵联合酶消化法可分离获取滑膜细胞、软骨细胞，实验操作简单、快捷，细胞贴壁快且细胞活性率较高，可在短时间内为实验研究提供大量目标细胞，为实验的进一步研究提供了方便。⑶构筑的滑膜细胞与软骨细胞共培养体系适用于OA微环境的研究，且该体系可模拟类OA关节内环境，适用于研究软骨损伤的进程。⑷滑膜及滑膜细胞的结构和功能与关节内微环境的平衡密切相关，这种微环境的失衡可导致软骨细胞结构和功能学活性的改变，可为OA发病的重要因素之一。