BMSCs-EPGFP-tk细胞介导HSV1-tk/GCV系统对A549细胞体外抑制/杀伤作用研究

摘要

目的：应用基因工程的方法构建pDON-AI-2Neo-HSV1-tk-IRES2-EGFP重组质粒，将HSV1-tk和EGFP双报告基因转染至小鼠骨髓间充质干细胞中，得到BMSCs-EGFP-tk细胞；观察其HSV1-tk基因的表达情况和对肺腺癌A549细胞体外抑制/杀伤作用，为肺癌基因治疗提供实验依据。
　　方法：应用PCR扩增技术从质粒pHSV106中扩增出HSV1-tk基因，借助pMD18-T载体构建重组质粒pHSV1-tk/18T；以限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ分别将重组质粒pHSV1-tk/18T和载体pIRES2-EGFP进行双酶切后，用DNA连接酶连接，构建重组质粒pHSV1-tk-IRES2-EGFP；同样的方法，再以限制性内切酶BglⅡ和HpaⅠ分别将重组质粒pHSV1-tk-IRES2-EGFP和逆转录病毒载体pDON-AI-2Neo双酶切后，用DNA连接酶连接，构建pDON-AI-2Neo-HSV1-tk-IRES2-EGFP重组质粒；并将逆转录病毒重组质粒进行病毒包装，获得具有感染能力的假病毒颗粒；并分别以脂质体法和逆转录病毒法瞬时转染/感染小鼠骨髓间充质干细胞，观察不同时间点，荧光显微镜下增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)在细胞内的表达；应用RT-PCR方法检测细胞中的HSV1-tk转录水平mRNA的表达情况；通过体外接触式共培养方法，将BMSCs-EGFP-tk细胞和肺腺癌A549细胞以2:1混合比例共培养24-48h后，加入1ug/ml浓度GCV，96h后以MTT方法检测自杀基因系统BMSCs-EGFP-tk/GCV体系对A549细胞体外抑制/杀伤作用。
　　结果：①：重组质粒通过双酶切鉴定和基因测序，结果表明，扩增的HSV1-tk基因序列正确，大小为1131bp，与GeneBank于报告的HSV1-tk基因序列完全一致；②经逆转录病毒包装的重组质粒以RT-PCR技术鉴定检测到HSV1-tk基因的mRNA表达；③利用阳离子脂质体法和逆转录病毒法分别转染/感染P3代小鼠BMSCs细胞，经EGFP荧光表达效率检测和RT-PCR检测鉴定(实验组在1131bp大小均出现电泳条带，同时内参引物在446bp处出现条带，对照组1131bp大小没有出现电泳条带)，两种方法均能将外源基因成功导入BMSCs细胞，逆转录病毒法感染效率明显高于脂质体法，差异具有统计学意义(P<0.05)；④BMSCs-EGFP-tk细胞和正常BMSCs细胞两者的形态特征基本一致，且生长特征无明显差别，长期正常培养15d后仍能观察到EGFP荧光表达和HSV1-tkmRNA表达；⑤BMSCs、BMSCs-EGFP-tk、A549细胞单独培养时，加入1ug/mL浓度GCV共培养96h后，细胞死亡率分别为0、87.42％、0.48％；当BMSCs-EGFP-tk：A549=2:1的比例，加入