TAT-NLS-Nkx6.2融合蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及其在脑中分布的初步研究

摘要

同源结构域Nkx6.2是由同源盒基因Nkx6.2编码产生。它作为一种反式作用因子，在中枢神经系统(central nervous system，CNS)胚胎期神经母细胞特化和生后期少突胶质细胞特化、成熟及髓鞘形成过程中，都发挥重要的调控作用。本课题组在前期研究中发现，脑发育时期甲状腺激素(thyroid hormone，TH)不足会造成CNS内重要神经细胞异常，同时伴随Nkx6.2低表达。然而，在因TH不足而导致的脑发育迟滞病理过程中，转录因子Nkx6.2具体的参与机制还不明确。通过给予甲状腺功能减低模型外源性Nkx6.2的方法，将有助于解决或部分解决这一问题。
　　改变基因表达水平的传统策略是基因转染，此技术存在插入诱变的风险。与之相比，直接转导目的蛋白内化进入细胞的方法，不仅可以避免这种风险，并且不会影响转导细胞的基因组表型。
　　因此，本文将TAT蛋白转导域(protein transduction domain，PTD)、核定位信号(nuclear location sequence，NLS)一起与Nkx6.2融合表达。首先，提取大鼠脑组织的总RNA，逆转合成cDNA后，通过PCR扩增获得大鼠Nkx6.2编码基因的外显子序列。同时，利用化学合成方法获得TAT、NLS的编码序列。然后，将以上目的基因插入融合型原核表达载体 pQE-30Xa，构建重组表达质粒pQE-30Xa/TAT-NLS-Nkx6.2(以下简称TN-Nkx6.2)。之后将其转化入E.coli M15[pREP4]进行融合表达，最终获得具有细胞渗透性的融合蛋白 TN-Nkx6.2。表达产物经Ni2+-IDA亲和层析纯化后，标记荧光染料(Cy7-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Cy7-N-hydroxysuccinimide ester，Cy7 NHS)。经尾静脉向小鼠注射Cy7-TN-Nkx6.2后，应用活体荧光成像系统监测融合蛋白在脑部的动态分布，结果表明，融合蛋白能够通过血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)到达脑组织；免疫荧光组化实验证明融合蛋白内化进入神经细胞胞浆、胞核；同时，该融合蛋白在短期内并未对脑组织细胞表现出明显的生物毒性。

目录

文摘

英文文摘

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、重组蛋白TN-Nkx6.2的克隆及表达

1 对象和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

二、重组蛋白TN-Nkx6.2脑中分布的初步鉴定

1 对象和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述

综述参考文献

致谢