TAT-NLS-Nkx6.2融合蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及其对神经干细胞分化的影响

摘要

目的:探讨同源盒基因Nkx6.2在因甲状腺素缺乏导致脑发育迟滞过程中的分子作用机制，获得能穿过血脑屏障的并跨膜进入细胞核的TN-Nkx6.2重组蛋白。本文旨在观察同源盒基因Nkx6.2对神经干细胞生长分化的影响。为进一步深入探讨同源盒基因Nkx6.2在甲状腺减低模型的作用机制奠定了物质基础。
　　 方法:本实验利用基因克隆技术，将TAT-NLS-Nkx6.2基因片段和空质粒pET-28a分别进行双酶切后，利用T4连接酶连接，将TAT-NLS-Nkx6.2及Nkx6.2基因克隆入pET-28a表达载体中，构建重组质粒pET-28a-TN-Nkx6.2及pET-28a-Nkx6.2，并将重组质粒pET-28a-TN-Nkx6.2及pET-28a-Nkx6.2转化入克隆菌E.coli DH5α中，再转化至E.coli BL21(DE3)中表达，经酶切及测序鉴定重组子，将酶切和测序正确的重组质粒保存于10％的甘油中，平板划线，挑取单菌落于抗Kan的LB培养基中过夜培养，按1∶50接种于抗Kan的LB液体培养基，当OD值为0.6左右时，用IPTG诱导目的蛋白表达，并对诱导条件如诱导时间，诱导温度，IPTG浓度进行优化，SDS-PAGE及Western Blot鉴定融合蛋白，pET-28a载体带有融合标签His· Tag，融合标签用于检测和纯化目的蛋白，经组氨酸Ni2+亲和层析纯化融合蛋白。将融合蛋白TN-Nkx6.2，Nkx6.2分别以不同浓度与神经干细胞孵育，免疫荧光细胞化学检测分化后的细胞类型，抗体分另别为NF-200、GFAP、Gal-C。
　　 结果:经酶切和测序证实成功构建了重组质粒pET-28a-TN-Nkx6.2及pET-28a-Nkx6.2，按1∶50的接种量接入摇瓶，37℃，250r/min培养约4h，当菌液的OD值为0.6时，增添终浓度为1mmol/L的诱导剂IPTG在25℃诱导8h后，融合蛋白的产量最高，能够在E.coli BL21(DE3)中高效表达融合蛋白TN-Nkx6.2，经SDS-PAGE电泳分析，结果显示目的蛋白的表达带的分子量与预期相符，经组氨酸Ni2+亲和层析纯化，得到高纯度的融合蛋白，经Western Blot鉴定，纯化后的融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性，融合蛋白为TN-Nkx6.2和Nkx6.2，融合蛋白TN-Nkx6.2能穿过细胞膜进入神经干细胞影响神经干细胞的分化，经荧光显微镜观察Gal-C的阳性细胞超过75％，有助于向少突胶质细胞方向发展，尤其以增加200μg/L、500μg/L融合蛋白TN-Nkx6.2的实验组最为明显，影响神经干细胞的发育和分化。
　　 结论:成功构建的重组质粒pET-28a-TN-Nkx6.2能够在E.coli BL21(DE3)中高效表达融合蛋白TN-Nkx6.2，并能穿过细胞膜进入神经干细胞，融合蛋白TN-Nkx6.2作为一种内源性蛋白，对神经干细胞的定向分化有一定的影响，作为一种信号使分化后的神经干细胞向少突胶质细胞方向发展。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、TN-Nkx6．2融合蛋白的表达纯化

1．1 对象和方法

1．1．1 实验材料

1．1．2 实验方法

1．2 结果

1．2．1 重组质粒的构建与鉴定

1．2．2 重组质粒的诱导表达及SDS-PAGE电泳鉴定

1．2．3 融合蛋白的Western Blot鉴定

1．2．4 融合蛋白的纯化与复性

1．2．5 Western Blot鉴定纯化后的融合蛋白

1．3 讨论

1．3．1 同源盒基因Nkxs

1．3．2 外源基因在原核细胞的表达及纯化

1．4 小结

二、融合蛋白TN-Nkx6．2对神经干细胞分化的影响

2．1 对象和方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．2 结果

2．2．1 神经干细胞的形态

2．2．2 神经干细胞分化鉴定

2．3 讨论

2．4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述 神经干细胞的研究进展

致谢