CD133+C6胶质瘤细胞体外侵袭能力及在大鼠C6胶质瘤模型体内分布侵袭模式研究

摘要

脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发肿瘤，约占所有成人中枢神经系统肿瘤的50％，中枢神经系统恶性肿瘤的78％。胶质母细胞瘤是恶性程度最高的胶质瘤，也是最具侵袭性的人类肿瘤之一。目前治疗胶质母细胞瘤的标准方案为最大限度的安全切除肿瘤实体，术后辅以放疗与替莫唑胺同步化疗及替莫唑胺化疗。由于肿瘤细胞在脑实质内呈弥漫浸润性生长，常不能实现满意的扩大切除。替莫唑胺是新型的烷化剂，脂溶性好，易透过血脑屏障，具有广谱的抗肿瘤活性，已成为新诊断胶质母细胞瘤患者术后辅助化疗的一线方案，其主要作用于增殖的细胞。尽管胶质母细胞瘤在治疗方面取得了很大的进步，接受标准方案治疗的新诊断的胶质母细胞瘤患者相对于单纯放疗的患者二年生存率由10.9％提高到27.2％，三年生存率由4.4％提高到16％，但胶质母细胞瘤的侵袭迁移生物学特性严重制约了疗效的进一步提高。除了胶质母细胞瘤侵袭特性是临床的主要挑战之外，肿瘤组织学上的高度不均一性也是严重的疗效制约因素。恶性胶质瘤中存在胶质瘤干细胞是组织学不均一性的重要表现。
　　肿瘤干细胞最早在白血病中发现，然后分别在乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌等上皮肿瘤中得到证实。胶质母细胞瘤中也存在一小部分这样的细胞，与神经干细胞相似，它自我更新，无限增殖，具有多向分化潜能，相对处于静止期，表达神经干细胞的标志物，在干细胞培养基中能形成细胞球，免疫缺陷小鼠原位移植能独立成瘤；通过分化标志物的异常表达、染色体的变异、肿瘤形成可以把胶质瘤干细胞与正常的神经干细胞相区分。胶质瘤干细胞可能启动肿瘤的发生和生长，主导侵袭和远处播散，导致治疗失败和复发。胶质瘤干细胞的侵袭能力如何，胶质瘤干细胞是否是侵袭的主力细胞，胶质瘤干细胞体内的分布规律和侵袭模式如何?本研究拟通过体外细胞培养和体内动物模型研究CD133+C6细胞的体外侵袭能力及在荷瘤大鼠颅内肿瘤模型和颅外模型中分布规律和侵袭模式，为临床更好的治疗恶性胶质瘤提供新的实验依据。
　　本课题研究分为以下二个部分：
　　第一部分利用干细胞培养基和免疫磁珠分选法获取C6大鼠胶质瘤细胞系中的CD133+细胞，光学显微镜观察干细胞球的形成过程。使用干细胞标记物CD133、Nestin免疫荧光鉴定贴壁细胞中的干细胞和干细胞球。Transwell侵袭实验检测CD133+细胞和CD133-细胞的侵袭能力，SD大鼠CD133+C6细胞耳朵模型检验胶质瘤干细胞的成瘤能力。结果是：成功分离和鉴定了C6细胞中的CD133+细胞；干细胞培养基中悬浮的干细胞第一天分裂成2到3个的细胞团，第二天可见数个的细胞团，4到5天后形成典型的细胞球；Transwell检测胶质瘤干细胞的侵袭能力，显示CD133+细胞比CD133-的侵袭能力强；从C6中分离的CD133+细胞能在大鼠体内形成肿瘤。
　　第二部分建立SD大鼠C6细胞的耳朵、皮下、颅内模型。10只SD大鼠，在大鼠的一只耳朵注射CD133+C6细胞，另一只注射CD133-C6细胞，实时观察肿瘤的形成和血管生成情况，结果显示CD133+C6细胞形成的肿瘤更大，更易形成异常密集的肿瘤血管，肿瘤血管呈烟雾状分布于肿瘤周。40只SD大鼠制作肋下皮下肿瘤模型，取不同生长阶段的皮下肿瘤，石蜡切片，免疫组织化学法染色CD133和HIF1α，观察同一时期CD133和HIF1α的表达是否有相关性，CD133阳性细胞分布与血管的关系。结果发现，随着皮下肿瘤的生长，出现缺血和坏死，CD133阳性的细胞逐渐趋向血管周聚集，而且CD133和HIF1α的组化染色半定量分析呈现出正相关。20只SD大鼠制作颅内原位胶质瘤模型，取颅内肿瘤制作石蜡切片和镜像切片，使用CD133，Nestin标记胶质瘤干细胞，Luxol FastBlue标记白质纤维束，Western blot检测颅内肿瘤不同部位CD133蛋白的表达情况。研究显示，CD133+C6细胞在肿瘤内分布于坏死区周，血管周；在肿瘤边界侵袭的前缘也有CD133+C6细胞分布，皇簇围绕于血管长轴，并分布于白质纤维束周及纤维束间，其细胞长轴与纤维束走行相一致。CD133蛋白在肿瘤的边缘和肿瘤与周围脑组织的交界区表达较强，在肿瘤所在的对侧大脑的胼胝体区也有很弱的表达。
　　结论：在体内和体外实验均证实CD133+C6细胞的侵袭能力强于CD133-细胞。CD133+C6细胞有很强的促血管生成能力。荷瘤鼠模型中CD133+C6细胞在肿瘤形成的初期并不分布于血管周；在肿瘤生长过程中CD133+C6细胞分布于坏死区的niche，血管周的niche，并出现在在肿瘤和脑组织交界的侵袭niche中。CD133+C6细胞在荷瘤鼠体内分布与侵袭模式可能与肿瘤内缺氧的微环境，及由缺氧引起基因表达变化有关。

目录

文摘

英文文摘

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、C6胶质瘤干细胞的体外特性

1.1 对象和方法

1.1.1 细胞系

1.1.2 主要仪器和试剂

1.1.3 实验方法

1.2 结果

1.3 讨论

1.4 小结

二、C6胶质瘤干细胞体内分布侵袭模式

2.1 对象和方法

2.1.1 材料

2.1.2 实验方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述

综述参考文献

致谢