转录因子Ikaros在肺癌发生发展中的功能和调控

摘要

目的：
　　研究Ikaros在肺癌发生发展中的作用，检测Ikaros的表达对肺癌细胞的生物学行为有何影响，并在人肺癌组织中检测Ikaros的表达与临床肺癌的分期、分型以及预后的关系；通过对IKZF1基因DNA甲基化、组蛋白修饰以及染色质的高级结构的研究判断Ikaros在肺癌细胞中异位表达的调控机制。通过这些研究，期望能够丰富人们对于肺癌发病原因的认识，为临床肺癌的诊疗提供资料。
　　方法：
　　1.Ikaros在肺癌发生发展中的功能研究
　　首先利用Westernblot检测在多个实体肿瘤细胞系中Ikaros的蛋白水平。细胞系包括，小细胞肺癌细胞：H209，H69；非小细胞肺癌细胞：H1155，A549，H441，LLC1；乳腺癌细胞：MCF-7，MDA-MB-231，SKBR3；正常内皮细胞和上皮细胞：HUVEC(HV)，Beas-2B；运用shRNA技术和过表达系统通过慢病毒体系人为改变肺癌细胞系中Ikaros的表达丰度，利用细胞划痕实验和Transwell实验来检测Ikaros对肿瘤细胞生物学行为的影响；利用Real-TimePCR检测跟细胞侵袭和迁移有关的基因包括(Nanog、ErbB2、SIP1、TGFα、α-SMA)的表达变化；利用免疫组织化学检测Ikaros在人肺癌中的表达情况。
　　2.Ikaros在肺癌细胞中异位表达的表观遗传机制研究
　　利用BLAST软件比较人和小鼠IKZ目的基因序列的同源性来推测保守的调控序列；利用Bisulfite-Sequencing方法检测U937，H209，H1155，A549，MDA-MB-231，Beas-2B细胞中Ikaros基因启动区的DNA甲基化程度；利用染色质免疫共沉淀(ChIP)技术在U937，H1155和A549细胞中检测H3K27乙酰化，H3K4单甲基化，H3K9乙酰化，H3K4双甲基化和H3K4三甲基化组蛋白修饰在IKZF1基因的分布；利用染色质构象捕获实验(3C)从染色质水平了解在肺癌细胞中IKZF1基因表达调控的机制。
　　结果：
　　1.Ikaros抑制肺癌的发生发展
　　Westernblot结果：表达Ikaros的细胞系有：H209，H69，H1155，H441和SKBR3细胞；运用shRNA成功下调了Ikaros在H69细胞的表达；运用构建质粒和细胞转染技术成功在A549细胞中过表达Ikaros；细胞的形态变化：在H69细胞中下调Ikaros的表达丰度之后，细胞的形态由原来的悬浮状态逐渐变为贴壁状态；在A549细胞中上调Ikaros的表达丰度后，原来的贴壁细胞逐渐变得贴壁不紧了；细胞划痕试验和Transwell试验结果：Ikaros的过表达能够抑制A549细胞的迁移能力和侵袭能力；Real-TimePCR结果：检测出Ikaros可抑制和细胞转移和侵袭相关基因(Nanog.ErbB2、SIP1、TGFα、α-SMA)的表达；免疫组化实验结果：检测到Ikaros在癌旁组织中不表达，在人的肺癌组织中低分化的肿瘤细胞中Ikaros的表达量多于高分化的肿瘤细胞。
　　2.DNA去甲基化是Ikaros在肺癌细胞中异位表达的主要调控机制
　　利用BLAST软件对人和小鼠的Ikaros基因序列进行比对，发现11个同源序列，分别为homo1，homo2，homo3，homo4，homo5，homo6，homo7，homo8，homo9，homo10和homo11；ChIP实验结果：H3K27乙酰化和H3K4单甲基化(这两种修饰是增强子的标志)在U937细胞系中的同源序列homo4、homo5和homo11有富集，而在H1155和A549细胞中无富集，说明这三个同源序列是潜在的增强子，而这三个增强子在H1155细胞中不具有功能；3C结果显示U937细胞中其启动子区与其上游的同源序列homo4、homo5和homo11在空间结构上相互接近，H1155细胞没有形成这样的高级结构，进一步证实homo4、homo5和homo11三个增强子只在U937细胞中活跃，在H1155细胞中尽管Ikaros异位表达，但增强子不起作用；H3K9乙酰化、H3K4二甲基化和三甲基化在U937细胞中的启动子区有明显的富集，在H1155和A549细胞中没有富集，说明组蛋白修饰的改变并非Ikaros异位表达的因素；Bisulfite-Sequencing实验结果表明：在Ikaros表达的U937，H209，H1155细胞中的DNA甲基化程度明显低于Ikaros不表达的A549，MDA-MB-231和Beas-2B细胞，说明DNA去甲基化是Ikaros在肺癌细胞H1155表达的原因。
　　结论：
　　Ikaros在肺癌细胞的表达可能通过抑制Nanog、ErbB2、SIP1、TGFα、和α-SMA的表达而抑制肿瘤细胞的迁移和侵润，说明Ikaros对肿瘤细胞的转移有抑制作用，这同已报道的Ikaros是血液肿瘤发生的抑癌基因相符，在临床人肺癌组织中，Ikaros主要在低分化的肺癌细胞中表达，结合这两部分结果，我们认为，Ikaros在肺癌细胞中的异位表达有可能促进肿瘤细胞的分化而对肿瘤的发展起抑制作用。
　　淋巴细胞中IKZF1基因的表达受到多个增强子的调控，这些增强子通过与启动子之间直接相互作用而使得活跃的IKZF1基因呈现出环状结构，在肺癌细胞中，Ikaros的异位表达是由于IKZF1基因的启动区发生去甲基化，增强子在Ikaros的异位表达并未发挥作用，因此在肺癌细胞中IKZF1基因仍然处于线性。