肾透明细胞癌血管内皮生长因子、内抑素的表达与超声造影相关性研究

摘要

肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身恶性肿瘤的3％，仅次于膀胱癌，居泌尿系肿瘤第二位。肾癌的发病率和死亡率在过去的50年中持续上升。患者初诊时约45％已有肿瘤转移，50％的肾癌患者术后有肿瘤复发。多年来应用分子免疫、基因治疗以及抗肿瘤血管形成的分子靶向治疗，对晚期或转移性肾癌已取得令人满意的疗效。在肿瘤研究中，大量的肿瘤相关因子表现出良好的应用前景，包括肿瘤细胞增殖相关因子、生长因子等。血管生成(Angiogenesis)是新血管从业已存在的成熟血管网中的芽生，对实体肿瘤的生长和转移起关键作用。肾癌是一种高度血管化肿瘤，研究证实其可以在体内外高表达血管内皮细胞生长因子(VEGF)。内皮抑素(ES)是一种内源性血管生成抑制因子，能特异抑制血管内皮细胞增殖和血管生成，其抗肿瘤活性在小鼠肿瘤模型得到证实。本实验目的是研究抑制和促进血管生成的调控因子，包括ES、VEGF和MVD在肾癌发病中的作用及其之间的相关性，为肾癌的生物学治疗提供理论依据。
　　由于肾癌早期症状不明显，血尿、腰痛、腹部肿块等相关症状出现时已经为晚期，治疗效果不佳。要提高肾癌的治疗效率，其早期诊断尤为重要。肾癌的筛查手段应具有简便、无创、廉价、敏感性较高等特点。超声检查完全符合以上要求，所以很长时间以来B超检查已经成为肾脏肿瘤筛查的首选物理检查手段。
　　但超声检查对于肾脏恶性肿瘤的定性诊断存在一定的局限性，尤其对内部出血坏死、囊性变及少血供的恶性肿瘤诊断有一定的困难。近年来超声造影(contrast-enhanced ultrasonography，CEUS)技术为肾脏恶性肿瘤的定性诊断提供了一种全新方法。目前国内外已有文献报道超声造影对肾脏良恶性肿瘤诊断的敏感性和特异性均较常规彩超检查有明显提高。本研究的目的是探讨超声造影技术在肾透明细胞癌诊断中的应用价值。
　　一、肾透明细胞癌MVD与VEGF、ES表达的相关性研究目的：研究肾癌血清和组织中血管生成调控因子-血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)、内皮抑素(Endostatin)表达与微血管密度
　　(microvessel density，MVD)与临床病理特征以及三者之间的相关性，为肾癌抗肿瘤血管生成靶向分子治疗的选择与评价提供实验依据。
　　材料和方法：①随机选择60例经临床确诊的肾癌患者为实验组，其中男37例，女23例；年龄45-73岁，平均年龄60.3岁，左侧34例，右侧26例，肿瘤最大径2.6-7.5 cm，平均4.7cm。按WHO分级标准，G116例，G225例，G39例。采用Robson分期，Ⅰ期22例，Ⅱ期24例，Ⅲ10例，Ⅳ期4例。30例健康志愿者为对照组，空腹抽取2ml血液标本，应用酶联免疫吸附法检测血清中VEGF和ES蛋白表达水平；②60例经病理证实的肾透明细胞癌石蜡包埋的组织标本和30例距肿瘤>2cm外区域的正常肾组织标本为对照组，采用单克隆抗体免疫组化SABC法检测VEGF、ES及MVD蛋白表达，所有染色切片均由两位富有经验的病理医生在同一条件下进行验证；记分标准参照为：随机选择10个高倍视野共记录1000个肾癌细胞，根据细胞浆的着色程度及着色细胞的百分率进行评分计算阳性系数：基本不着色者为0分，着色淡者为1分，着色适中者为2分，着色深者为3分。着色细胞占计数细胞百分率≤5％为0分，6％-25％为1分，26％-50％为2分，≥51％为3分。将每张切片着色程度得分与着色细胞百分率得分各自相乘，即为阳性系数。阳性系数为0，1分为(-)，2，3分为(+)，4-6分为(++)，如为9分为(+++)。统计学分析软件采用SPSS13.0软件包。计量资料以均值±标准误表示，计数资料以率或百分比表示，相关性分析采用Spear-man秩和相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。
　　结果：①肾癌血清VEGF、ES的表达：60例肾透明细胞癌与对照组比较，其VEGF表达值为(0.22±0.12 ng/ml vs0.08±0.02 ng/ml，；ES为(65.87±20.03 ng/ml vs37.85±18.49 ng/ml，两组经统计学处理差别显著，P<0.01。血清VEGF、ES的表达与性别、病理分期无显著性差别(P>0.05)。②肾癌组织中VEGF、ES表达率：①肾癌组织中VEGF、ES蛋白的阳性表达率为(76.7％ vs23.4％，X2=32.673)，与于癌旁正常。肾组织相比差别显著，P<0.01)；②VEGF、ES蛋白表达水平与肾癌分期有关，Ⅲ-Ⅳ期肿瘤与Ⅰ-Ⅱ期肿瘤病例相比VEGF的表达率为(84.7％vs72.1％，X2=25.731)，P<0.05；与性别和病理类型无显著相关性(P>0.05)。③肾癌组织ES蛋白的表达显著高于癌旁正常肾组织(77.2％ vs34.8％，X2=13.591，P<0.01)。Ⅲ-Ⅳ期肾癌ES蛋白表达的水平与Ⅰ-Ⅱ期肾癌病例相比，差别显著升高，(P<0.05)；④肾癌组织中的MVD阳性表达率均明显高于癌旁正常肾脏组织，(34.76±11.78 vs17.75±8.53，t=8.124，P<0.01)。晚期(Ⅲ-Ⅳ期)的MVD表达率显著高于早期Ⅰ-Ⅱ期肾癌(45.39±9.67 vs27.64±8.13，t=10.274，P<0.01)；⑤肾癌组织中VEGF与MVD存在显著相关性(r=6.271，P<0.05)、ES与MVD(r=12.024，P<0.05)、ES与VEGF显著相关(r=8.571，P<0.05)、的表达均具有显著相关性。
　　二、肾透明细胞癌超声造影的血管特征与WVD的相关性研究
　　目的：应用超声造影(contrast-enhanced ultrasonography，CEUS)探讨肾透明细胞癌血管显象特征与MVD表达的相关性及其在诊断中的应用价值。
　　方法：回顾性分析40例经病理确诊结果为肾透明细胞癌患者的瘤灶内灌注过程及回声变化，并运用时间-强度曲线分析软件对储存的动态图像进行定量分析。对肾透明细胞癌超声造影模式进行分型，并探讨其与临床病理特点的相关性。
　　结果：与周边正常肾皮质对比，肾透明细胞癌组织始增时间(开始强化时间)早、强化程度高，强化持续时间长，时间-强度曲线弧度较高，声学定量参数峰值强度、曲线尖度及曲线下面积大，达峰时间短(P均<0.05)。肾透明细胞癌超声造影模式分四型：Ⅰ型：快进快出型11(27.5％)例，Ⅱ型：快进慢出型17(42.5％)例，Ⅲ型：同进同出型7(17.5％)例，Ⅳ型：慢进慢出型5(12.5％)例；增强模式以不均匀增强(27/40，67.5％)以及弥漫性增强(33/40，82.5％)为主；前3型病理学表现为低分化，血管丰富，而间质成分较少；Ⅳ型病理学表现为高分化，间质成分较多，而血管较少。超声造影剂达峰强度与MVD具有正相关性(P<0.01)。
　　结论：①肾透明细胞癌患者的血清VEGF表达水平明显升高，且与肿瘤分期相关，提示血清VEGF可作为肾癌，特别是晚期肾癌抗肿瘤血管分子靶向治疗选择与疗效评价具有应用价值。②肾癌患者ES与VEGF水平与肾癌MVD、肿瘤分期升高相关，ES水平在血清，肾癌组织中的升高可能是肾癌血管形成调控的生物反应，ES起正反馈调控作用，这种反应有助于抑制VEGF促血管生成作用；提示VEGF、ES是肾癌血管形成过程中的关键调控因子。③超声造影肾透明细胞癌血管的显像特征，时间-强度曲线和定量分析技术能准确显现肾透明细胞癌的血流灌注特点；④在增强模式上，肾透明细胞癌表现为快进快出型和快进慢出型，常伴有弥漫性及不均匀强化；肾癌超声造影的血管特征与MVD显著相关，提示肾癌超声造影血管显像技术可在手术前或对晚期肾癌的血管判定及其抗肿瘤血管分子靶向治疗选与疗效评价，是一种快速、简便，无创的诊断方法。高速超声造影在肾癌诊断中的价值得期待。