Annexin a2与Stat3的相互作用在人乳腺癌中的功能研究

摘要

目的:
　　 膜联蛋白Annexina2（以下简称Anxa2）是一种钙依赖蛋白，广泛高表达于各种癌组织中，在肿瘤血管生成、细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭以及粘附等功能中起多重作用。本组前期研究发现，Anxa2能够调节乳腺癌细胞的增殖和迁移能力，并调节细胞周期相关蛋白C-myc，CyclinD1和侵袭相关蛋白MMP-2，MMP-9的表达。这些蛋白都是信号转导和转录激活因子3(Signaltransducerandactivatoroftranscription3，Stat3)的下游响应因子。本组前期研究发现，Anxa2和和Stat3间存在相互作用，但是Anxa2本身并没有影响Stat3的表达水平。Anxa2与Stat3都是酪氨酸磷酸化蛋白，因此我们推测Anxa2可能通过自身的酪氨酸磷酸化来调节Stat3的磷酸化，进而调控Stat3下游响应蛋白因子的表达。本实验应用点突变技术，获得Anxa2基因的持续激活和持续抑制的两种突变体，通过感染/转染技术，获得稳定表达相应蛋白的细胞模型，在已有研究结果上进一步探索Anxa2第23位酪氨酸的磷酸化对于其自身活性及其调节乳腺癌细胞增殖、迁移与侵袭所起的作用，并为研究Anxa2与Star3相互作用的机制寻找新的线索。
　　 方法:
　　 1.应用亚克隆技术，获得表达Anxa2及其第23位酪氨酸的突变体的载体质粒，pCDH-EGFP-Anxa2WT,pEGFP-N3-Anxa2Y23A和pEGFP-N3-Anxa2Y23D。采用慢病毒感染以及脂质体转染技术，获得表达Anxa2-WT及其突变体Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D的SK-BR-3及MCF-7稳定细胞系。
　　 2.应用MTT实验检测Anxa2-WT,Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D对SK-BR-3和MCF-7细胞的增殖能力的影响。
　　 3.应用克隆形成实验检测Anxa2-WT,Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D对SK-BR-3和MCF-7细胞的克隆形成能力的影响。
　　 4.应用划痕实验检测Anxa2-WT,Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D对MCF-7细胞的体外迁移能力的影响。
　　 5.采用transwell小室体外迁移、侵袭实验检测Anxa2-WT,Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D对SK-BR-3和MCF-7细胞的体外迁移、侵袭能力的影响。
　　 6.应用RT-PCR技术来检测Stat3在乳腺癌患者的导管内癌、浸润性导管癌中的mRNA表达水平，并分析与Anxa2mRNA表达水平的相关性。
　　 7.采用免疫共沉淀技术检测SK-BR-3细胞中Anxa2与Stat3的相互作用。
　　 8.应用Westernblotting技术检测Anxa2-WT,Anxa2-Y23A，和Anxa2-Y23D对周期相关蛋白CyclinD1表达水平的影响。
　　 9.应用Westernblotting技术检测Anxa2-WT,Anxa2-Y23A，和Anxa2-Y23D对Stat3在乳腺癌细胞SK-BR-3细胞核和浆中的分布和激活的影响。
　　 结果:
　　 1.亚克隆技术获得野生型的重组慢病毒质粒pCDH-EGFP-Anxa2WT，并获得Anxa2的突变质粒pEGFP-N3-Anxa2Y23A和pEGFP-N3-Anxa2Y23D。
　　 2.重组/突变质粒成功感染/转染人乳腺癌细胞株SK-BR-3和MCF-7。
　　 3.野生型Anxa2-WT及其突变体Anxa2-Y23A，Anxa2-Y23D在乳腺癌细胞株SK-BR-3和MCF-7中稳定表达。
　　 4.免疫荧光检测野生型Anxa2-WT主要定位于乳腺癌细胞株SK-BR-3和MCF-7中细胞膜和浆。
　　 5.Anxa2-WT和Anxa2-Y23D增强乳腺癌细胞的增殖与克隆形成能力。
　　 6.Anxa2-WT和Anxa2-Y23D提高乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。
　　 7.Stat3mRNA在乳腺癌浸润性导管癌中的表达水平明显高于癌旁组织(P＜0.0001)和导管内癌(P＜0.0001)中的表达;并与Anxa2mRNA在浸润性导管内癌中的表达具有相关性。
　　 8.免疫共沉淀发现Stat3与Anxa2在SK-BR-3细胞中存在相互作用。
　　 9.免疫印迹发现总裂解液中Anxa2-WT,Y23D对Stat3表达水平没有影响，但是生长因子刺激后P-Stat3的表达水平有提高趋势，而细胞周期蛋白CyclinD1的表达则明显提高。
　　 10.免疫印迹发现Y23D能够促进Stat3的磷酸化，活化的Stat3进入细胞核中。
　　 结论:
　　 1.Anxa2第23位酪氨酸磷酸化对于其促进乳腺癌增殖、迁移和侵袭具有重要作用。
　　 2.Anxa2第23位酪氨酸磷酸化能够促进Stat3的磷酸化，从而使其活化并进入核中调节下游靶蛋白因子的表达，最终调节乳腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭。

目录

声明

摘要

缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、Anxa2及其突变体质粒的构建

1．1 对象和方法

1．1．1 质粒来源

1．1．2 主要试剂

1．1．3 主要仪器设备

1．1．4 引物设计

1．1．5 PCR合成突变基因质粒

1．1．6 转化

1．1．7 酶切

1．1．8 连接

1．1．9 鉴定

1．2 结果

1．2．1 点突变获得Anxa2的突变质粒

1．2．2 亚克隆技术获得重组慢病毒质粒pCDH-EGFP-Anxa2WT

二、Anxa2第23位酪氨酸磷酸化促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭

2．1 对象和方法

2．1．1 细胞来源

2．1．2 细胞培养

2．1．3 细胞实验

2．1．4 生化分子实验方法

2．1．5 统计方法

2．2 结果

2．2．1 重组／突变质粒成功感染／转染人乳腺癌细胞株

2．2．2 获得稳定表达Anxa2-WT， Anxa2-Y23A， Anxa2-Y23D的细胞株

2．2．3 免疫荧光检测Anxa2-WT在细胞中的定位情况

2．2．4 Anxa2-WT和Anxa2-Y23D增强细胞的增殖能力

2．2．5 Anxa2-WT和Anxa2-Y23D增强细胞的克隆形成能力

2．2．6 Anxa2-WT和Anxa2-Y23D促进MCF-7细胞的迁移和侵袭

2．2．7 Anxa2-WT和Anxa2-Y23D促进SK-BR-3的迁移和侵袭

2．3 讨论

2．3．1 Anxa2第23位酪氨酸磷酸化增强乳腺癌细胞的增殖能力

2．3．2 Anxa2第23位酪氨酸磷酸化促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭

2．4 小结

三、Anxa2第23位酪氨酸磷酸化促进Stat在核内的活化

3．1 对象和方法

3．1．1 标本来源

3．1．2 试剂配制

3．1．3 实验方法

3．2 结果

3．2．1 Stat3 mRNA在乳腺癌相关组织中的表达情况

3．2．2 Stat3与Anxa2的mRNA在浸润性导管内癌中的表达相关

3．2．3 Stat3与Anxa2在SK-BR-3细胞中具有相互作用

3．2．4 Anxa2-WT，Y23A，Y23D对Stat3与P-Star3表达水平的影响

3．2．5 Anxa2-WT对EGF刺激后P-Anxa2和P-Star3表达水平的影响

3．2．6 Anxa2-WT，Y23A，Y23D对Cyclin D1表达水平的影响

3．2．7 Anxa2-Y23D能够促进细胞核中Stat3的磷酸化

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述 Annexin a2在肿瘤的发生和发展中所起的作用

致谢