miR-29异常减少在胶质瘤发生发展中的作用及其机制研究

摘要

目的: 近来的研究表明，miR-29家族(miR-29a、miR-29b、miR-29c，miR-29s)是一种重要的抑瘤微小RNA（TS-miRNA），其表达异常减少与多种颅外恶性肿瘤的发生、发展密切相关。生物信息学预测显示细胞分裂周期蛋白42(CDC42)及细胞周期依赖性激酶(CDK6)是miR-29家族的潜在靶基因，且两者表达水平随多种肿瘤恶性程度升高而相应增加。但是，胶质瘤细胞中miR-29s及其上述靶基因的表达有何改变，其与胶质瘤良恶性级别的关系及在胶质瘤发生发展中的作用及如何，尚不清楚。胶质瘤细胞中CDC42和CDK6是否是miR-29s的天然靶基因，miR-29s敲低上述靶基因表达的机制如何尚需进一步证实。此外，外源性miR-29s对胶质瘤细胞迁移、侵袭、增殖、凋亡和细胞周期分布有何影响，miR-29s特异性敲低CDC42和CDK6表达是否是其发挥上述抑瘤作用的分子机制亦需观察验证。本研究以不同级别人胶质瘤标本和人胶质母细胞瘤细胞系为研究对象，对上述问题进行研究。
　　 方法: ①采用锁定寡核苷酸探针原位杂交及免疫组织化学方法，检测60例不同级别胶质瘤组织标本及10例对照脑组织中miR-29a/b/c及Ki-67抗原的表达水平。②采用荧光素酶实验在胶质瘤细胞系U87MG及U251中验证CDC42是否是miR-29s的天然靶基因，通过检测转染miR-29a/b/c mimics后上述细胞系CDC42 mRNA及蛋白表达水平的变化，探索miR-29s敲低CDC42表达的分子机制。③通过体外迁移、侵袭实验观察转染miR-29a/b/c等量混合物（miR-29mix组）后U87MG及U251细胞侵袭迁移能力的改变;通过观察外源性CDC42能否逆转上述改变证实特异性敲低CDC42表达是否是miR-29s抑制胶质瘤细胞迁移、侵袭的分子机制。④观察miR-29mix组Ki-67阳性标记指数的变化及补充外源性CDC42对该变化的影响，对比稳定过表达miR-29a/b/c的各U251亚细胞系与scr过表达U251亚细胞系和U251细胞系克隆形成效率的差异，以明确miR-29对恶性胶质瘤细胞增殖的抑制作用及其分子机制。⑤通过Caspase3/7活性检测和流式凋亡检测，观察转染miR-29mix后胶质母细胞瘤细胞系凋亡水平的改变及共转染CDC42对细胞凋亡的挽救效应;比较miR-29s/CDC42通路对U87MG细胞系（p53野生型）及U251细胞系(p53突变型)凋亡诱导作用的差异及其对野生和突变型p53表达水平影响的差异，明确该通路调控恶性胶质瘤细胞凋亡的机制及其与p53结构和功能的关系。⑥通过构建过表达miR-29c的SNB19胶质瘤亚细胞系(p-miR29c)及对照无义序列过表达亚细胞系(p-scr)，观察miR29c对恶性胶质瘤细胞CDK6 mRNA和蛋白表达及细胞周期分布和增殖活性的影响，探索miR-29s抑制胶质瘤细胞增殖的分子机制。
　　 结果: ①原位杂交结果显示，WHOⅠ～Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤组的miR-29a阳性标记指数(LI％)分别为21.30±18.20、4.53±2.54、1.46±0.52，并均明显低于非肿瘤对照脑组织的LI％（46.37±26.38，P＜0.001）;miR-29b阳性标记指数(LI％)分别为17.37±12.87、5.06±2.87、1.49±0.71，并均明显低于非肿瘤对照脑组织的LI％（39.89±26.76，P＜0.001）;miR-29c阳性标记指数(LI％)分别为18.93±11.94、5.54±3.81、1.77±0.95，并均明显低于非肿瘤对照脑组织的LI％（53.66±23.66，P＜0.001）;miR-29a/b/c表达水平随着胶质瘤良恶性级别的升高相应降低，各组之间的差异均有统计学意义(P＜0.001)。而Ki-67表达水平则呈相反趋势，对照脑组织的Ki-67阳性细胞密度最低（0.00±0.00），且其表达水平随胶质瘤良恶性级别增加相应升高(WHOⅠ～Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级组分别为9.30±3.48、31.15±9.44、60.15±13.60);各组间的差异均有统计学意义（P＜0.01）。经直线相关分析证实，miR-29a/b/c与Ki-67指标之间呈显著性负相关(r=-586、r=-625、r=-599，P＜0.01)。②荧光素酶实验结果显示，在胶质瘤细胞里，miR-29s可通过与野生型CDC42的3'UTR特异性结合，介导其对荧光素酶报导基因表达的沉默作用;因miR-29s变型CDC423'UTR结合，当用二者共转染胶质瘤细胞时不能沉默荧光素酶报导基因的表达;从而证实CDC42是miR-29s的天然靶基因。与相应的对照组细胞相比，miR-29s转染组细胞的miR-29a/b/c表达水平明显升高，而CDC42 mRNA及蛋白表达水平均明显降低，说明miR-29a/b/c可以通过直接降解CDC42mRNA阻断CDC42表达。③迁移、侵袭实验结果显示，miR-29家族可有效抑制胶质母细胞瘤细胞系的迁移和侵袭能力，外源性CDC42可部分逆转miR-29s对肿瘤细胞迁移侵袭的影响;④miR-29mix转染组细胞Ki-67阳性标记指数LI(％)和克隆形成效率均明显低于对照组细胞，补充CDC42后可部分逆转miR-29mix mimics转染细胞的LI(％)。⑤miR-29mix转染的U87MG(p53野生型）细胞Caspase3/7活性明显高于对照组细胞，FCM中miR-29mix mimics转染的U87MG细胞其凋亡指数明显高于对照组细胞。外源性CDC42可部分降低miR-29mix mimics转染U87MG细胞的Caspase3/7活性及凋亡指数。而miR-29mix mimics转染的U251（p53突变型）各细胞Caspase3/7活性及凋亡指数与对照组细胞相比无显著性差异。⑥与SNB19及SNB19-scr相比，SNB19-miR-29c G0/G1期细胞比例明显增高，而S期及G2/M期比例相应降低，同时SNB19-miR-29c的克隆形成效率亦明显低于两个对照（亚）细胞系。
　　 结论: ①随着胶质瘤恶性度的升高，miR-29a/b/c表达水平降低，而CDC42表达水平增加，二者呈显著负相关，miR-a/b/c和CDC42表达水平可作为评价胶质瘤生物学行为及患者预后的重要参考指标。②研究转染miR-29a、miR-29b、miR-29c及miR-29mix过表达细胞系可相应高表达miR-29a、miR-29b、miR-29c及miR-29mix，是研究miR-a/b/c抑瘤效应的理想细胞模型③CDC42是miR-29a、miR-29b、miR-29c的天然靶基因，miR-29a、miR-29b、miR-29c可通过降解其mRNA和阻断其翻译过程在转录后和翻译两个水平特异性敲低CDC42的表达。④miR-29s可有效抑制恶性胶质瘤细胞的迁移和侵袭，CDC42表达下调是miR-29s抑制迁移侵袭的机制之一。⑤miR-29s可通过敲低CDC42表达抑制恶性胶质瘤细胞的增殖活性。⑥miR-29s可诱导恶性胶质瘤细胞的凋亡，该作用是p53依赖型的并与其阻断CDC42表达有关。⑦miR-29c可通过敲低CDK6表达诱导G1期阻滞抑制胶质瘤细胞的增殖活性。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

第一部分：miR-29s靶向CDC42对胶质瘤抑瘤作用的研究材料与方法

材料与方法

1．主要实验仪器

2．实验材料

3．实验方法

结果

1．胶质瘤细胞miR-29s表达与其增殖活性的关系

2．胶质瘤细胞中miR-29s靶基因的预测

3．胶质瘤细胞中miR-29s靶基因的鉴定

4．miR-29通过靶向CDC42抑制胶质瘤细胞侵袭迁移

5．miR-29上调wtp53表达对胶质瘤细胞增殖和凋亡影响

第二部分：miR-29c靶向CDK6对胶质瘤抑瘤作用的研究

材料与方法

1．主要实验仪器

2．实验材料

3．实验方法

结果

1 miR-29c靶mRNA的生物信息学预测

2 miR-29c与CDK6表达的相互关系

3 miR-29c对SNB19细胞增殖活性的影响

讨论

1．不同级别胶质瘤细胞miR-29s表达变化与其增殖活性的关系

2．在胶质瘤细胞中miR-29s可阻断CDC42的表达

3．miR-29s通过阻断恶性胶质瘤细胞CDC42表达抑制其迁移侵袭

4．miR-29s可抑制恶性胶质瘤细胞增殖和促进其凋亡

5．miR-29c可通过诱导G1期阻滞抑制胶质瘤细胞增殖

6．结束语

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 miR-29与肿瘤的相关研究新进展

致谢