研究转甲状腺素蛋白化学修饰在老年性淀粉样变形成机制中的作用

摘要

目的：转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)主要由肝脏实质细胞和脉络丛细胞合成与分泌，具有转运甲状腺素和视黄醇的功能，已证实其为老年性系统性淀粉样变(senile systemic amyloidosis，SSA)和家族性淀粉样多发性神经病变(familialamyloidotic polyneuropathy，FAP)患者淀粉样变的前体蛋白。相关研究已证实淀粉样变成分呈无分枝纤维状结构，目前对于机体内TTR蛋白如何聚合形成淀粉样变纤维，进而沉积于相应组织器官的形成机制还未阐明。本实验旨在通过对TTR蛋白化学修饰与淀粉样变纤维形成之间关系的研究，探讨TTR代谢组学在SSA淀粉样变形成中的作用。
　　 方法：⑴根据SSA诊断标准，收集确诊SSA患者4例。依据TTR基因库设计四对外显子引物，PCR扩增外显子，同时测序扩增产物，检测TTR基因是否存在突变。⑵应用ProteomeLab PF-2D系统，缓冲液洗脱范围为pH8.5～4，以pH每变动0.3为单位，收集不同pH条件下洗脱的蛋白。⑶采用BCA(BicinchoninicAcid)方法，对各个组分蛋白含量进行测定。⑷利用硫磺素T(Thioflavin-T，ThT)能够与淀粉样变成分特异性结合的性质，对各个收集组分的荧光强度进行分析。⑸采用抗人-TTR抗体，Dot blot检测各个收集组分中的TTR蛋白。⑹利用超高效液相色谱/四级杆-飞行时间串联质谱(ultra performance liquidchromatography coupled with quadrupole-time of flight mass spectrometry,UPLC/Q-TOF MS)技术，解析血清中TTR蛋白代谢组学修饰特点。
　　 结果：①PCR扩增结合基因测序，分析TTR基因四个外显子来判断SSA患者TTR基因为均未发生突变，属于野生型TTR。②ProteomeLab PF-2D系统分离血清TTR，应用连续pH梯度洗脱，将血清蛋白划分为46份，同时监测蛋白峰度，发现SSA患者与健康对照组血清蛋白存在有3个主要蛋白吸收峰。③BCA蛋白定量检测并未发现两组间有明显不同。④硫磺素T特异检测淀粉样变荧光强度试验，在pH7.8～6.7和pH5.6～4.8部分荧光强度增高，同时TTR免疫反应阳性说明存在淀粉样变荧光成分。⑤Dot blot鉴定TTR蛋白存在的范围，发现SSA患者pI7.83～7.61之间TTR含量较高、对照组在pI7.95～7.72范围TTR含量较多，提示两者间TTR蛋白存在化学修饰差异。⑥超高效液相色谱/四级杆-飞行时间串联质谱(UPLC/Q-TOF MS)技术解析分析TTR化学修饰，SSA患者TTR修饰类型Dehydration ST、Phosphoryl STY、Hydroxyl DKNP、Carbamidomethyl C、Phosphopantetheine S和O-GlcNac ST明显减少。
　　 结论：⑴利用PF-2D技术，依据蛋白质在系统梯度中所呈现的电荷极性洗脱蛋白，在不影响淀粉样变纤维结构的pH条件下梯度洗脱收集血清TTR蛋白，为进一步研究TTR蛋白代谢修饰与淀粉样变纤维形成模型奠定基础。⑵发现SSA患者血清TTR蛋白修饰类型，Dehydration ST、Phosphoryl STY、Hydroxyl DKNP、Carbamidomethyl C、Phosphopantetheine S和O-GlcNac ST修饰减少，而Th-T结合实验荧光强度增高。TTR蛋白4个单体间依靠疏水结构吸引彼此形成聚合体，表面为亲水基团，上述修饰类型均为极性修饰基团，提示SSA患者由于血清TTR蛋白修饰类型减少引发该蛋白分子表面极性分子减少，疏水性增强，进而导致TTR分子四聚体稳定性减弱，进一步聚合形成淀粉样变纤维，推测TTR蛋白极性修饰的减少可能参与SSA淀粉样变形成。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

研究转甲状腺素蛋白化学修饰在老年性淀粉样变形成机制中的作用

1 对象和方法

1．1 研究对象

1．2 试剂

1．3 实验仪器

1．4 实验方法

2 结果

2．1 血清TTR蛋白突变检测结果

2．2 ProteomLab PF-2D分离血清标本结果

2．3 BCA蛋白含量检测结果

2．4 Th-T特异性结合实验检测结果

2．5 Dot blot鉴定目的蛋白TTR结果

2．6 UPLC／Q-TOF MS分析对比结果

3 讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述 淀粉样变纤维与淀粉样聚集检查方法的研究进展

致谢