兔自身免疫性干眼调节性T细胞及细胞因子的研究

摘要

目的：
　　 干眼是眼科最常见疾病之一，而自身免疫性干眼如Sjogren's综合征(Sjogren's syndrome，SS)相关干眼是泪液缺乏型干眼的主要原因。干燥综合征的发病机制尚未明确，研究认为免疫调节、激素、基因、病毒、神经和环境改变等众多因素均参与了SS的致病过程。近年研究指出，调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)功能异常促进了干燥综合征的发生发展。本文的研究目的是建立稳定的兔自身免疫性干眼模型，结合临床表现、组织病理，对泪液系统内调节性T细胞及相关细胞因子的表达进行分析，研究调节性T细胞在自身免疫性干眼发病中所起作用。
　　 方法：
　　 1.分离提纯兔泪腺上皮细胞，对分离的原代细胞进行活性鉴定并培养。
　　 2.泪腺上皮细胞独立培养2天后，分离自体外周血淋巴细胞，以1∶1比例将二者混合培养。BrdU检测外周血淋巴细胞的增殖比率。
　　 3.诱导兔自身免疫性干眼:将激活的自体淋巴细胞经耳缘静脉回输供体兔体内。回输细胞前及回输后2周、4周、6周、8周分别观察兔角膜染色、泪膜破裂时间、泪液分泌等临床体征，回输细胞4周后处死，收集双侧上泪腺、下泪腺及结膜进行组织病理HE染色。
　　 4.取泪腺组织提取总RNA，real-time PCR检测细胞因子IL-6、IL-10、IL-17、TNF-a、TGF-β、IFN-γ的表达。
　　 5.流式细胞仪检测泪腺组织、脾脏中CD4+CD25+Treg比例变化。
　　 6.免疫磁珠分选CD4+CD25+Treg，使其与泪腺上皮细胞及外周血T淋巴细胞混合共培养，BrdU检测CD4+CD25+Treg对效应T细胞是否起到抑制作用。
　　 结果：
　　 1.成功分离获得纯度较高的兔泪腺上皮细胞。
　　 2.建立兔泪腺上皮细胞与自体外周血淋巴细胞的混合共培养体系，自体外周血淋巴细胞被泪腺上皮细胞激活，BrdU检测增殖比率为3.71。
　　 3.成功建立兔自身免疫性干眼模型:激活的淋巴细胞回输回体内可以诱导产生兔自身免疫性干眼。与正常组相比，干眼模型组泪液分泌显著减少(P＜0.05)，泪膜破裂时间缩短(P＜0.05)，荧光素钠染色显示角膜弥漫点状着色。静脉注射激活的淋巴细胞4周后，泪腺和结膜组织HE染色均显示淋巴细胞浸润。
　　 4.real-time PCR结果显示，与对照组相比，干眼模型组泪腺中炎性因子IL-6、IL-17、TNF-a、IFN-γ的表达呈不同程度增加，抑炎因子IL-10，TGF-β的表达明显降低(P＜0.05)。
　　 5.流式细胞术检测结果显示，在兔干眼模型中，脾脏和泪腺组织中CD4+CD25+Treg细胞比例降低。
　　 6.CD4+CD25+Treg可以抑制泪腺特异性效应T细胞的增殖。
　　 结论：
　　 经自体泪腺细胞刺激激活的外周血淋巴细胞通过耳缘静脉回输后可诱导稳定的兔干眼模型，在兔干眼发病过程中，CD4+CD25+Treg细胞免疫抑制作用减弱，Th17细胞功能亢进，细胞因子TNF-a、IFN-γ、IL-10、TGF-β、IL-6参与泪腺中炎症反应。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

1．1 实验动物与材料

1．1．1 实验动物

1．1．2 实验所用的主要仪器和设备

1．1．3 主要试剂及溶液配制

1．2 方法

1．2．1 兔泪腺上皮细胞分离和原代培养

1．2．2 泪腺上皮细胞的鉴定

1．2．3 分离兔外周血淋巴细胞

1．2．4 建立自体细胞混合共培养体系

1．2．5 自身免疫千眼模型的制备

1．2．6 干眼相关临床指标的检测

1．2．7 样本收集及组织病理染色

1．2．8 泪腺组织总RNA提取

1．2．9 泪腺组织总RNA逆转录

1．2．10 Quantitative real-time PCR(qPCR)实时定量PCR

1．2．11 流式细胞术测定CD4+CD25+Treg细胞

1．2．12 免疫磁珠分选调节性T细胞

1．2．13 统计学处理

1．3 结果

1．3．1 泪腺上皮细胞培养与活性鉴定

1．3．2 自体淋巴细胞增殖检测结果

1．3．3 临床指标检测结果

1．3．4 组织病理染色

1．3．5 细胞因子检测结果

1．3．6 流式细胞术检测调节性T细胞结果

1．3．7 调节性T细胞的抑制作用

1．4 讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 Sj?gren综合征相关性干眼发病机制的研究进展

致谢