以天然骨基质明胶/软骨细胞外基质复合山羊椎间盘细胞构建一体化组织工程椎间盘的实验研究

摘要

目的：探讨以骨基质明胶/软骨细胞外基质复合山羊椎间盘细胞构建一体化组织工程椎间盘的可行性。
　　 方法：⑴取猪股骨，将猪股骨近端松质骨经脱钙、脱细胞处理后，制备外径为10mm、内径5mm、高3mm的骨基质明胶环;刮取猪股骨近端软骨，经研磨、脱细胞处理制成匀浆;Hoechst33258染色检测两种支架材料脱细胞情况，再将软骨匀浆注入骨基质明胶环中央，经冷冻干燥、交联后制备成一体化纤维环-髓核双相支架;扫描电镜、HE、天狼星红染色观察支架结构;检测支架的孔隙率、吸水率以及敷水状态的压缩力学性能（力学性能与正常猪尾椎间盘对比）。⑵消化分离山羊纤维环细胞及髓核细胞，倒置显微镜下观察细胞形态，同时对第1代细胞进行甲苯胺蓝、番红O染色以及Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色;将第1代纤维环细胞及髓核细胞分别以密度1×107个/ml接种至支架的纤维环相及髓核相上，体外培养2d，倒置显微镜、扫描电镜、组织学染色观察细胞在支架上的粘附情况，LIVE/DEAD染色观察细胞在支架上的活性;细胞支架复合物分别培养2w和4w，Real-time PCR技术检测支架中椎间盘细胞的Ⅰ、Ⅱ型胶原、聚集蛋白多糖的基因表达水平（正常椎间盘组织中的椎间盘细胞作为对照）。⑶获取足够数量的第1代纤维环细胞及髓核细胞，将两种细胞均进行PKH26染液标记，检测PKH26染液标记前后的髓核细胞生物学特性;将椎间盘细胞以密度1×107个/ml接种至支架的相应部位，细胞支架复合物体外培养2d后，将其植入裸鼠背部皮下;体内培养6w后，肉眼观察裸鼠背部植入部位情况，小动物活体荧光成像系统检测体内荧光分布情况;处死裸鼠，取出细胞支架复合物，行冰冻切片，在荧光显微镜下观察，同时行Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组化染色以及番红O染色。
　　 结果：①Hoechst33258染色示支架材料脱细胞后未见细胞残留;支架敷水后，大体观察外层纤维环相呈乳白色，髓核相为透明状，两相分界明显;扫描电镜下支架孔隙分布均匀，孔隙相互连通，纤维环相孔径为（372.3±139.8）μm，髓核相孔径为（112.4±21.8）μm; HE染色显示支架交界区界限清晰，连接紧密，支架淡染;天狼星红染色示纤维环相深红色，髓核相呈红黄绿相间色;支架孔隙率为73.37％±2.56％，吸水率为655.7％±78.6％;敷水状态下，支架的压缩弹性模量为49.06±15.57 kPa，正常猪尾椎间盘压缩弹性模量为135.9±28.9kPa，两者比较差异有统计学意义，P＜0.05。②镜下纤维环细胞呈长梭形，髓核细胞呈短梭形或卵圆形，两种细胞在第5代开始出现衰老的形态表现;第1代纤维环细胞及髓核细胞甲苯胺蓝、番红O染色均为阳性，纤维环细胞Ⅰ型胶原免疫组化染色阳性、Ⅱ型胶原免疫组化染色弱阳性，髓核细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性、Ⅰ型胶原免疫组化染色弱阳性;细胞接种支架后，倒置相差显微镜下、扫描电镜、HE染色观察两种细胞在支架上粘附良好，LIVE/DEAD染色示两种细胞在支架上呈绿色荧光;Real-timePCR检测示支架上椎间盘细胞的聚集蛋白多糖、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原基因表达水平均比正常椎间盘细胞显著增高。③PKH26染液标记后的纤维环细胞及髓核细胞在荧光显微镜下均呈红色荧光，且荧光分布均匀，标记前后髓核细胞的增殖及聚集蛋白多糖、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原基因表达无明显差异(P＞0.05);细胞支架复合物体内培养6w后，肉眼观察在裸鼠皮下植入部位周围无感染及炎症反应，细胞支架复合物呈圆盘状，与皮肤内面愈合，小动物活体荧光成像系统显示在髓核相及纤维环相上均可见有荧光分布;荧光显微镜下，纤维环相及髓核相上均可见点状红色荧光;Ⅰ型胶原免疫组化染色纤维环相及髓核相均呈阳性;Ⅱ型胶原免疫组化染色纤维环相呈阴性，髓核相呈弱阳性;番红O染色纤维环相呈弱阳性，髓核相呈阳性。
　　 结论：以天然骨基质明胶/软骨细胞外基质复合山羊椎间盘细胞可以初步构建一体化组织工程椎间盘。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、以骨基质明胶及软骨细胞外基质构建一体化纤维环-髓核双相支架的实验研究

1．1 对象和方法

1．1．1 实验材料及试剂

1．1．2 实验试剂配制

1．1．3 实验仪器

1．1．4 实验方法

1．1．5 统计学分析

1．2 结果

1．2．1 Hoechst 33258染色

1．2．2 大体观察

1．2．3 扫描电镜观察

1．2．4 组织学染色

1．2．5 孔隙率、吸水率测定及生物力学检测

1．3 讨论

1．3．1 支架材料的选择依据

1．3．2 去细胞方法和异种移植问题

1．3．3 一体化支架的冷冻干燥与交联

1．3．4 一体化支架的理化性能

1．4 小结

二、椎间盘细胞的分离培养及一体化椎间盘支架的细胞生物相容性评估

2．1 对象和方法

2．1．1 实验材料及试剂

2．1．2 实验试剂配制

2．1．3 实验仪器

2．1．4 实验方法

2．1．5 统计学分析

2．2 结果

2．2．1 椎问盘细胞分离及培养

2．2．2 椎间盘细胞组织学及免疫细胞化学染色

2．2．3 一体化支架细胞生物相容性评估

2．2．4 细胞支架复合物Realtime-PCR检测

2．3 讨论

2．3．1 椎间盘细胞分离及培养

2．3．2 一体化支架细胞生物相容性评估

2．2．3 Real-time PCR检测

2．4 小结

三、以天然骨基质明胶／软骨细胞外基质复合山羊椎间盘细胞裸鼠体内异位构建组织工程椎间盘的实验研究

3．1 对象和方法

3．1．1 实验材料及试剂

3．1．2 实验试剂配制

3．1．3 实验仪器

3．1．4 实验方法

3．15 统计学分析

3．2 结果

3．2．1 椎间盘细胞PKH26标记

3．2．2 小动物活体成像系统观察

3．2．3 组织工程化椎间盘评估

3．3 讨论

3．3．1 椎间盘细胞PKH26标记

3．3．2 小动物活体成像分析

3．3．3 组织工程化椎间盘评估

3．4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 组织工程髓核的研究进展

致谢