HBcAb阳性供肝组织内cccDNA检测及与肝移植术后乙肝复发的关系

摘要

[目的]检测乙肝核心抗体阳性供肝组织内HBVcccDNA，结合肝移植术后乙肝复发率，探讨HBcAb阳性供肝中cccDNA与术后HBV复发的关系。
　　 [方法]实验分为两部分。
　　 第一部分:建立检测供肝组织中HBVcccDNA的荧光定量PCR检测体系。根据入组病例的种族和地理分布特点，在GenBank选取HBV常见B、C基因型50株的全基因组序列，结合HBVrcDNA、HBVcccDNA结构特点选择相对保守的序列设计HBVcccDNA选择性引物和探针。根据cccDNA的结构和生物学特点，利用PSAD消化去除rcDNA和整合型HBVDNA的干扰后，利用跨越缺口的选择性引物扩增，延长到探针结合位点时，利用其外切酶活性将探针切断，产生荧光信号。以pCP10质粒构建标准曲线，β-actin作为内参照，对供肝组织提取的DNA样本进行PSAD消化后进行cccDNA检测，确定引物的最佳退火温度和检测灵敏度。
　　 第二部分:HBcAb阳性供肝组织内HBVcccDNA的荧光定量PCR检测与术后HBV的复发率的关系。2007年1月至2010年1月因乙肝相关性疾病在我院行肝移植手术患者1200例，根据实验分组、入选标准、排除标准，选取病例共85例，其中男性65例，女性20例，年龄18-65岁，平均为44.55±12.37岁，随访18-60个月，平均随访32.12±10.06个月。分为实验组（HBcAb阳性供肝、HBsAg阴性，n=40）、对照组（HBsAg阳性供肝，n=15）、正常组(无肝炎供肝，n=30)三组。入选标准:1）年龄18-65岁，性别不限;2）HBsAg或HBsAg和DNA阳性;3）签署知情同意;4）预计术后存活6个月以上者。排除标准:1）术前血清学HBsAg阴性;2）预计术后生存期＜6个月者;3）存在其它肝炎病毒混合感染;4）HBV病毒变异者;5）严重药物过敏者。利用第一部分创建的方法，检测供肝组织内的HBVcccDNA。所有患者肝移植术后给予HBIG联合核苷类药物预防乙肝复发方案。定期检测HBV血清学及HBVDNA，如有HBsAg阳性或HBV-DNA阳性者取肝穿活检病理确认复发。计算乙肝复发率，探讨HBcAb阳性供肝中cccDNA与术后HBV复发的关系。
　　 实验结果采用SPSS16.0统计软件对数据进行x2检验。p＜0.05为差异有统计学意义。
　　 [结果]
　　 第一部分:成功建立了检测供肝组织中HBVcccDNA的荧光定量PCR检测体系。
　　 第二部分:入组患者共85例，实验组、对照组及正常组分别有12例、11例和0例cccDNA检测呈阳性，其阳性率分别为30％(12/40)、73.3％(11/15)、0。实验组与对照组的HBVcccDNA阳性率的差异有统计学意义(x2=8.419P=0.004)。
　　 实验组、对照组及正常组术后HBV的复发率分别为10％(4/40)、80％(12/15)和3.3％(1/30)。实验组与对照组术后HBV的复发之间差异有统计学意义(x2=25.913P＜0.001)。实验组、正常组术后HBV的复发之间差异无统计学意义(x2=1.149P=0.284)。实验组cccDNA(+)与cccDNA(-)的供肝术后HBV的复发率分别为7.5％(3/40)、2.5％(1/40)，术后HBV复发之间差异有统计学意义(x2=4.286P=0.038)。
　　 [结论]
　　 1、成功建立了检测供肝组织中HBVcccDNA的MGB探针荧光定量PCR方法，可用于石蜡组织中供肝内HBVcccDNA的检测。
　　 2、HBcAb阳性供肝中cccDNA可能是术后HBV复发的危险因素之一。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、供肝组织内HBVcccDNA荧光定量PCR检测体系的建立

1．1 实验材料和方法

1．1．1 实验仪器与试剂

1．1．2 pCP10质粒

1．1．3 临床标本的处理

1．1．4 POR引物和探针设计

1．1．5 HBVcccDNA荧光定量检测方法的建立

1．1．6 荧光域值的设定及Ct值与起始模板的关系

1．2 结果

1．2．1 荧光定量PCR检测体系的质量控制

1．2．2 荧光定量PCR检测结果

1．3 讨论

1．4 小结

二、HBcAb阳性供肝组织内HBVcccDNA的荧光定量PCR检测与术后HBV的复发率的关系

2．1 材料和方法

2．1．1 临床资料

2．1．2 实验仪器与试剂

2．1．3 石蜡供肝组织内DNA的提取

2．1．4 石蜡组织中供肝的HBVcccDNA的检测

2．1．5 随访患者HBVDNA、Hbsag的检测及肝脏穿刺活检确定乙肝复发

2．1．6 统计学意义

2．2 结果

2．2．1 HBVcccDNA的检测

2．2．2 实验组、对照组及正常组移植术后HBV的复发率的比较

2．2．3 实验组cccDNA(+)与cccDNA(-)移植术后HBV的复发率的比较

2．3 讨论

2．3．1 HBVcccDNA的检测

2．3．2 HBcAb阳性供肝HBVcccDNA的检测与乙肝复发的关系

2．4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 HBcAb阳性移植供肝用于乙型肝炎病毒相关性肝病患者的研究进展

致谢