前列腺癌冷冻治疗后高迁移率族蛋白B1影响DC凋亡的机制研究

摘要

目的：
　　 探讨前列腺癌细胞系氩氦冷冻消融处理后高迁移率族蛋白B1(high mobilitygroup protein B1，HMGB1)的释放规律，以及HMGB1诱导异体外周血来源树突状细胞(dendritic cell，DC)凋亡的分子机制。
　　 材料和方法：
　　 前列腺癌细胞系PC-3、DU-145体外培养，氩氦冷冻消融系统（Endocare氩氦冷冻系统，美国，直径1.7mm冷冻器）冻融肿瘤细胞，收集冷冻坏死细胞上清液，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测冷冻处理前后肿瘤细胞上清液中HMGB1的浓度。采集前列腺癌患者新鲜外周血（抗凝），应用Ficoll淋巴细胞分离液，贴壁方法分离出单个核细胞(PBMC)，利用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介素4(rhIL-4)体外诱导并培养，获取幼稚DC细胞(iDC)。流式细胞仪测定肿瘤细胞冷冻坏死液干预前后的DCs表面TLR-2和TLR-4受体表达率;预先使用TLR-2/TLR-4封闭抗体处理iDC，随后与肿瘤细胞冷冻坏死液在体外适宜培养条件下共培养，流式细胞术测定DCs凋亡率。
　　 结果：
　　 1.PC-3细胞系的ELISA结果:1×105/ml组、1×106/ml组、1×107/ml组PC-3细胞培养基中HMGB1浓度分别为（65.78±4.57）ng/ml、（96.73±7.64）ng/ml、(137.73±13.37) ng/ml，冷冻消融后上清液中HMGB1浓度为（150.88±6.78）ng/ml、（187.3±5.69）ng/ml、（285.2±27.45）ng/ml，差异具有统计学意义(P＜0.01);
　　 2.DU-145细胞系的ELISA结果:1×105/ml组、1×106/ml组、1×107/ml组DU-145细胞培养基中HMGB1浓度分别为（30.44±0.25）ng/ml、（45.78±0.13）ng/ml、(66.82±0.18) ng/ml，冷冻处理后上清液中HMGB1浓度上升至（58.47±0.84）ng/ml、（98.1±4.62）ng/ml、（157.59±32.89）ng/ml，差异具有统计学意义(P＜0.01)。
　　 3.流式细胞术检测结果:iDC细胞表面低表达TLR-2、TLR-4（15.4±3.87Vs.5.17±7.22），肿瘤细胞冷冻坏死液刺激后表达率明显升高(45.2±5.58Vs.11.48±7.55), P＜0.05。
　　 4.流式细胞术（Annexin V-FITC）检测各干预组DCs凋亡率:肿瘤细胞冷冻坏死液与DCs共培养前后，DC细胞凋亡率（5.25±0.46）％Vs.（73.56±0.90）％;TLR-2、TLR-4抗体封闭后，冷冻坏死细胞液诱导DCs凋亡率（38.5±8.61）％Vs.(56.85±7.14)％，（P＜0.05）。
　　 结论：
　　 1.流式细胞术检测前列腺癌细胞氩氦冷冻消融后的死亡形式，显示大部分细胞呈碎裂坏死状态。
　　 2.ELISA检测冷冻消融前后肿瘤细胞上清液中HMGB1的浓度，结果显示:前列腺癌细胞冷冻消融处理后HMGB1大量释放，肿瘤细胞的数量也是影响HMGB1浓度的因素。
　　 3.流式细胞术检测发现，幼稚DC细胞低表达TLR-2和TLR-4受体，前列腺癌细胞冷冻坏死液可明显促进DC细胞表面TLR-2和TLR-4受体表达率。
　　 4.肿瘤细胞冷冻坏死液与DCs共培养后诱导DC细胞凋亡;利用TLR-2和TLR-4抗体封闭DC细胞，明显抑制了肿瘤细胞冷冻坏死液诱导的DC细胞凋亡。
　　 总之，前列腺癌冷冻消融后，大量肿瘤细胞坏死伴随HMGB1大量释放。HMGB1作为一种内源性的危险信号分子与DC细胞作用，诱导DC细胞凋亡，削弱了冷冻免疫反应。研究发现，HMGB1可能通过TLRs诱导DC细胞凋亡，TLRs抗体可抑制HMGB1诱导DC细胞凋亡的效果，提高冷冻免疫治疗的效果。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

材料和方法

1．1 材料和方法

1．1．1 主要仪器设备

1．1．2 购买试剂

1．1．3 配制试剂

1．1．4 肿瘤细胞系及DC细胞来源

1．2 实验方法及步骤

1．2．1 PC-3、DU-145细胞培养

1．2．2 氩氦冷冻处理前列腺癌细胞及标本收集

1．2．3 流式细胞术(Annexin V-FITC)检测冷冻消融后细胞活性

1．2．4 酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测肿瘤细胞冷冻前后上清液中HMGB1的含量

1．2．5 幼稚树突状细胞(iDC)的培养

1．2．6 流式细胞术检测细胞表面受体表达及凋亡率

1．3 统计分析

结果

2．1 冷冻消融对肿瘤细胞活性的影响

2．1．1 冷冻前后细胞形态变化

2．1．2 流式细胞术(Annexin V／PI)检测冷冻处理后的肿瘤细胞死亡形式

2．2 肿瘤细胞氩氦冷冻消融后上清液中HMGB1的表达

2．3 树突状细胞(DC)的形态观察

2．4 冷冻干预前后树突状细胞表面受体的表达

2．5 不同干预体系诱导DCs凋亡情况

2．5．1 肿瘤细胞冷冻坏死液对DC细胞凋亡的影响

2．5．2 抗体干预后冷冻坏死液对DC细胞凋亡率影响

讨论

3．1 冷冻消融后前列腺癌细胞分泌HMGB1的变化规律

3．2 DCs参与的前列腺癌冷冻免疫反应

3．3 HMGB1诱导DC凋亡的机制---TLRs信号途径

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述一 高迁移率族蛋白在抗肿瘤免疫中的研究进展

综述二 局限期前列腺癌的治疗进展

致谢