ATM介导的Mad1与dCK磷酸化在细胞周期检测点及DNA损伤修复中的功能

摘要

人类正常细胞时刻遭受各种内源性（例如细胞内正常代谢过程中的副产物氧自由基）及外源性（例如日光中波长为200-400纳米的紫外线）基因毒性因子等作用导致DNA损伤。鉴于此，各种细胞周期监测点的最重要的功能被认为是检测DNA损伤;并且在能被修复的情况下诱导细胞周期停滞指导修复过程的完成。
　　共济失调性毛细血管扩张症突变蛋白(ataxia-telangiectasia-mutated,ATM)名称来源于失调性毛细血管扩张症。它属于磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(Phosphatidylinositol3-kinase-related kinases，PIKKs)超家族。在DNA损伤后被募集于损伤部位并被激活。激活后的ATM导致其下游为数众多的参与DNA损伤修复或激活细胞周期检测点的底物被快速磷酸化。多个独立的大规模蛋白组学研究结果已发现规模庞大的DNA损伤反应性磷酸化蛋白网络。例如，有研究发现了DNA损伤反应性共济失调性毛细血管扩张症突变蛋白(ataxia-telangiectasia-mutated，ATM)与共济失调毛细血管扩张症和RAD3相关蛋白(Ataxia telangiectasia and Rad3-related protein,ATR)等超过700种蛋白的多达900个的磷酸化共同识别位点。其中包含有丝分裂停滞缺陷蛋白1(mitotic arrest-deficient protein1，Mad1)丝氨酸214位点及脱氧胞苷激酶(Deoxycytidine kinase，dCK)丝氨酸74位点。这两处磷酸化在我们的前期实验中得到证实。因此本研究目的在于探讨Mad1丝氨酸214位点及dCK丝氨酸74位点磷酸化参与DNA损伤修复中的机制。兹分述如下:
　　第一部分:
　　纺锤体组装检查点(The spindle assembly checkpoint，SAC)和DNA损伤修复检查点是生物进化过程中两个保守的机制。正因为有这些机制，尽管有各种DNA损伤，有丝分裂中染色体分离的高保真度依旧受到保护。这两个机制一直以来被认为是各自独立发挥作用的。但是越来越多的证据显示在此两种机制中发挥作用的蛋白其功能是相互重叠的。先前我们的实验已证实作为纺锤体组装检查点的关键组成蛋白-有丝分裂停滞缺陷蛋白1(mitotic arrest-deficient protein1，Mad1)同样在DNA损伤修复过程中发挥作用。我们发现敲除Mad1会导致细胞对电离辐射高度敏感，而且组蛋白伽马H2AX在DNA损伤部位聚集灶持续时间延长（组蛋白H2AX在丝氨酸139磷酸化被称为伽马H2AX，它是DNA双链断裂的敏感标志物，在DNA双列断裂位点灶状聚集）。纺锤体组装检查点是真核细胞基因组稳定性得以保持的关键自身监控机制之一。在所有染色体被来自纺锤体两级的纺锤体微管连接以前，纺锤体组装检查点(The spindle assembly checkpoint，SAC)会阻止细胞从有丝分裂中期进入后期。有丝分裂停滞缺陷蛋白1（mitotic arrest-deficient protein1，Mad1）作为SAC的关键组分在有丝分裂中磷酸化。值得注意的是Mad1不论在有丝分裂及电离辐射诱导的DNA损伤修复(DDR)过程中均过磷酸化。在这两个过程中Mad1磷酸化是依赖于ATM的。ATM本身在有丝分裂中被激活，并且在SAC中发挥作用。本研究通过体外试验证实Mad1在丝氨酸214位点被ATM磷酸化。此位点磷酸化的Mad1促进其同源二聚体及其与有丝分裂停滞缺陷蛋白2(mitotic arrest-deficient protein2，Mad2)异源二聚体的形成;进一步显示ATM介导的丝氨酸214位点磷酸化对SAC的激活是至关重要的。综上所述，表明ATM依赖性的Mad1磷酸化在SAC及DDR中具有双重功能。
　　第二部分:
　　细胞周期监测点是保证高保真真核细胞分裂的调控机制;在各个细胞周期时相监测点均有相应的许多蛋白参与。脱氧胞苷激酶(Deoxycytidine kinase，dCK)是内源性DNA合成过程中脱氧核苷磷酸化及一些外源性抗癌、抗病毒核苷类似物磷酸化的关键限速酶。dCK在DNA损伤后被激活，但其在DNA损伤修复中的作用机制在很大程度上尚不清楚。本研究结果显示，dCK在电离辐射诱导的DNA损伤修复中细胞周期G2/M检测点发挥作用。我们发现ATM通过磷酸化dCK丝氨酸74位点激活其对DNA损伤的反应。我们的研究进一步证实dCK丝氨酸74位点磷酸化是细胞周期G2/M检测点的启动分子事件。使用质谱分析，进一步发现了dCK在DNA损伤修复中籍以发挥功能的复合物，包括Elongation facor1delta，CDC2(Cdk1)，prohibitin2，HSP90及Methylome subunit Plcln等，而其中与细胞周期进展最为相关的两个蛋白是Cdk1和prohibitin2。细胞内外研究发现电离辐射诱导dCK与细胞周期蛋白依赖性激酶1(cyclin-dependent kinase1，Cdk1)直接相互作用，并且抑制其功能，从而导致G2/M期阻滞。综上所述，本研究发现了dCK新的功能。从另一个方面来看，本研究也发现了DNA损伤修复中细胞周期G2/M检测点新的调节机制。
　　总之，Mad1、dCK及Bub均为ATM磷酸化底物，不论受到DNA损伤抑或有丝分裂纺锤体损伤剂刺激的情况下。除了在DNA损伤修复中被人熟知的作用，本研究结果进一步证实了我们之前关于ATM在纺锤体装配检验点中发挥重要功能的论述。阐明细胞周期检查点的详细作用机制，如Mad1在纺锤体装配检验点及dCK在G2/M检查点的机理，不仅使我们对最基本和经典的生物过程有进一步了解，也具显见的应用价值。如Mad1的异常表达(已在多种肿瘤中被发现)能够诠释多种肿瘤标志性的生物学行为------非整倍体的发生及对放化疗的抗性等。dCK的重要功能已被广泛记述，比如在DNA合成及磷酸化核苷类似物的前体药应用于抗癌及抗病毒，因此，对dCK的深入研究也有潜在的临床意义。

目录

声明

摘要

Abstract

Abbreviations／Symbols

Introduction

1．DNA damage and response

2．Cell cycle checkpoints

3．Ataxia telangiectasia mutated(ATM)

4．Problems to be solved and prospective

PART Ⅰ ATM-mediated Mad1 Serine 214 phosphorylation is required for homo-and hetero-dimerization and for the spindle assembly checkpoint

1．1 Materials and methods

1．2 Results

1．3 Discussion

1．4 Summary

Part Ⅱ Deoxycytidine kinase regulares the G2／M checkpoint through interaction with cyclin-dependent kinase 1 in response to DNA damage

2．1 Material and methods

2．2 Results

2．3 Discussion

2．4 Summary

Conclusions

Thesis innovations

References

Publications and participation in scientific research acticities situation

Review What do we know about Mad1?

致谢