血清特异性microRNA作为尘肺早期诊断生物标志物的研究

摘要

目的：
　　 目前，对尘肺的诊断主要采取职业史结合影像学的方式，一旦确诊，病人肺纤维化进程已无法逆转。虽然尘肺病的防治主要在于控制工作环境的粉尘浓度，但是探索早期的诊断指标，从“二级预防”出发，为预防尘肺提供科学依据。因此，寻找尘肺早期诊断的生物标志物，对于早期发现疑似病人，早治疗，降低尘肺和职业性肿瘤等重大职业病的发病率，具有重大的经济和社会效益。本课题旨在筛选尘肺病人血清中特异表达的microRNA(miRNA)，探索血清miRNA作为尘肺早期生物标志物的诊断价值。
　　 方法：
　　 采用TaqMan低密度芯片(TLDA)的方法，筛选出候选的可作为尘肺的筛查诊断及预后预测的血清miRNA标志物，并采用RT-qPCR方法进行验证。通过病例对照研究和统计分析，得到可用于尘肺筛查诊断的血清生物标志物，并绘制受试者工作曲线评估候选的血清miRNA标志物对尘肺的诊断价值，比较其灵敏度和特异性。最终拟合出多个候选miRNA用于尘肺早期筛查、早期诊断、预后预测的联合应用模型。
　　 结果：
　　 1.通过TaqMan低密度芯片方法筛选出在正常对照组、尘肺组之间血清中有一定表达差异的10个候选miRNA，用RT-qPCR方法在Ⅰ期尘肺130例，Ⅱ期尘肺22例和对照152例血清样本中进行验证，均可检测到有效表达。
　　 2.与健康对照组相比，尘肺样本中6个miRNA呈高表达，分别为miR-21、miR-200c、miR-16、miR-206、miR-155、miR-29a，1个呈低表达(miR-204)，差异均有显著性。
　　 3.Ⅰ、Ⅱ期尘肺间的比较:结果显示miR-204、miR-21在Ⅰ、Ⅱ期尘肺中的表达量存在差异性，miR-21在对照组以及Ⅰ、Ⅱ期尘肺中表达递增，miR-204在对照组以及Ⅰ、Ⅱ期尘肺中表达递减。
　　 4.拟合6个有尘肺筛查诊断价值且灵敏度和特异性良好的血清miRNA建立尘肺和正常人群中筛查诊断的Logistic回归模型:logitP=13.769+0.536×miR-21-0.878×miR-200C-0.012×miR-16-0.111×miR-206+0.117×.miR-155-1.192×miR-29a，其AUC-ROC为0.980(95％ CI:0.970-0.993,P＜0.0001)。
　　 结论：
　　 1.利用TaqMan低密度芯片绘制尘肺血清miRNA表达谱，方法可靠可行。
　　 2.血清miRNA可望作为尘肺筛查诊断的标志物，具有潜在的应用价值。
　　 3.通过血清miRNA的表达水平，可以提示尘肺发病进程。
　　 4.多个血清miRNA联合应用检测可改善尘肺诊断的灵敏度和特异性，有望作为经典诊断标准的辅助指标提高早期尘肺诊断的准确性。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

对象和方法

1 研究对象

2 流行病学调查与肺功能检查

2．1 具体指标的定义

2．2 尘肺临床资料的定义

3 标本采集和保存

4 实验材料

4．1 实验试剂

4．2 实验仪器

4．3 溶液配制

5 实验方法

5．1 血清总RNA的纯化

5．2 逆转录

5．3 预扩增

5．4 RT-qPCR法检测血清中miRNA表达水平

5．5 TaqMan?低密度芯片(TaqMan? Low Density Array，TLDA)

6 统计学分析方法

结果

1 TLDA扩增结果

2 筛选miRNA标志物标准

3 病例对照的基本情况

3．1 基本情况分析

3．2 肺功能检测结果

4 大规模验证血清miRNA表达分析

4．1 对照组与尘肺病例组比较

4．2 对照组与不同分期尘肺组间比较

5 不同组别miR-204和miR-21表达与肺功能相关性分析

6 候选miRNA标志物尘肺筛查的灵敏度和特异性

7 用于尘肺诊断的多个血清miRNA联合应用模型

讨论

1 miRNA机制研究

2 miRNA的检测技术

3 血清／血浆中的miRNA及其检测

4 尘肺的发病机制与现有的早期诊断指标

5 血清miRNA作为尘肺筛查、诊断的生物标志物

6 尘肺早期诊断候选出的血清miRNA标志物的研究

7 miR-204、miR-21与肺功能的相关性分析

8 多个血清miRNA联合应用于尘肺的早期诊断

9 血清miRNA作为尘肺诊断的优势和局限性

结论

参考文献

综述 miRNA及其在脏器纤维化和肺癌中的作用机制的研究进展

发表论文和参加科研情况说明

附录 调查表(部分节选)

致谢