RNAi抑制CAR基因对人肺鳞癌细胞系NCI-H520裸鼠皮下移植瘤生长的影响

摘要

目的:
　　 利用RNAi干扰技术，干预人高表达柯萨奇病毒腺病毒受体(coxsackievirusand adenovirus receptor，CAR)肺鳞状细胞癌NCI-H520细胞系中CAR的表达，通过体外细胞学试验及体内动物模型的构建，观察比较干预前后肺鳞癌细胞体外增殖活性的变化和裸鼠体内成瘤率及对瘤体生长等方面的影响，进一步来验CAR与肺癌的关系。
　　 方法:
　　 1将针对CAR mRNA序列设计的小干扰RNA重组质粒分别以脂质体转染至人肺鳞状细胞癌NCI-H520细胞，并经G418抗性筛选得到稳定细胞系。
　　 2采用半定量RT-PCR和Western blot检测3个稳定表达细胞系和阴性对照、空白对照组细胞中CAR mRNA和蛋白质的表达情况，判断抑制效果并筛选出抑制效果最佳的一组稳定表达细胞系。
　　 3用平板克隆形成实验观察RNA干扰抑制CAR基因表达对NCI-H520肺鳞癌细胞系体外增殖能力的影响。
　　 4通过绘制肿瘤生长曲线，动态观察瘤体的生长，进一步来验证CAR对肺癌的增殖是否有促进作用。
　　 结果:
　　 1筛选出了抑制CAR基因表达效果最佳的一组shRNA，并建立了能稳定而有效抑制CAR基因表达的肺鳞状细胞癌NCI-H520细胞系。
　　 2利用半定量RT-PCR和Western blot检测方法结果显示，三组稳定细胞系中CARmRNA水平和蛋白质含量均有不同程度的下降。其中shRNA-2抑制作用最强，其对CAR mRNA和蛋白质表达的抑制率分别达到82.5％和79.8％，本研究选用shRNA2重组质粒进行后续的实验。
　　 3关于CAR与肺癌肿瘤细胞体外增殖能力的关系，本研究在平板克隆形成实验中发现，转染shRNA-2质粒的NCI-H520细胞抑制CAR基因表达后，其体外增殖能力稍有下降，但是其差异无统计学意义(P＞0.05)，其原因和机制有待于进一步分析和研究。
　　 4在肿瘤形成实验中，裸鼠肺癌移植模型构建成功，为以后肺癌的研究奠定基础。与平板克隆形成实验结果不同，利用RNAi干扰有效抑制了CAR基因的表达后，实验组裸鼠移植瘤增殖能力与空白对照组和阴性载体对照组相比，瘤体生长减缓，移植瘤体积、重量明显减小(P＜0.01)。说明沉默CAR基因的表达后，该组裸鼠的肿瘤形成能力明显降低了，进一步说明了CAR基因与肺癌的增殖能力有密切关系。
　　 结论:
　　 裸鼠肺癌移植模型构建成功，为以后肺癌的研究奠定基础。利用RNAi干扰有效抑制了CAR基因的表达后，NCI-H520细胞体外增殖能力的变化不明显，但却有效抑制了NCI-H520细胞在裸鼠体内移植瘤的生长，其原因和机制还有待于深入研究，但具体机制仍然需要进一步研究。因此，充分了解CAR在肿瘤生长过程中以及在腺病毒介导的基因治疗中的作用机制。将大大增进对恶性肿瘤生物学本质的了解，同时为恶性肿瘤的治疗提供新的、更为有效的平台。CAR有望成为肺癌基因治疗的靶点之一。

目录

声明

摘要

缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

对象和方法

1．1 细胞系

1．2 主要试剂

1．3 实验仪器

1．4 实验方法

1．4．1 细胞培养

1．4．2 RT-PCR检测肺鳞癌细胞系NCI-H520中CAR mRNA的表达

1．4．3 Western blot检测肺鳞癌细胞系NCI-H520中CAR蛋白的表达

1．4．4 重组质粒的转染和稳定表达细胞株的筛选

1．4．5 平板克隆形成实验

1．4．6 动物模型的构建

1．4．7 统计学分析

结果

2．1 质粒DNA纯度测定

2．2 成功建立RNAi稳定表达细胞系

2．3 应用RT-PCR方法鉴定CAR mRNA表达干扰的抑制效果

2．4 应用Western blot检测CAR蛋白表达干扰的抑制效果

2．5 平板克隆形成实验转染后对细胞增殖的影响

2．6 肿瘤形成实验结果

2．6．1 绘制肿瘤生长曲线

2．6．2 三组裸鼠移植瘤生长情况

2．6．3 裸鼠移植瘤组织的病理形态学特点

讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 柯萨奇病毒腺病毒受体在肿瘤发生机制中的研究进展

致谢