TGFβ3对人Tenon’s囊成纤维细胞以及细胞外基质的影响

摘要

目的:抗青光眼术后手术失败的主要原因是术后滤过泡瘢痕化，即结膜下组织----Tenon's囊成纤维细胞（human tenon's fibroblasts，HTF）大量增殖及分泌大量的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，促进滤过道瘢痕的形成。本实验旨在研究转化生长因子β3（transforming growth factor beta3，TGFβ3）对HTF增殖及ECM的影响。
　　方法:运用组织块培养法进行原代培养HTF。采用RT-PCR及免疫荧光分别从基因及蛋白水平鉴定所培养的细胞为成纤维细胞。选取P3细胞作为研究对象。以TGFβ3刺激HTF作为实验研究对象，比较不同刺激浓度:0ng/ml、0.1 ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、50ng/mlTGFβ3刺激HTF细胞增殖情况。以TGFβ2刺激HTF作为阳性对照，比较不同浓度0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、50ng/ml，不同时间1天、2天、3天直到7天刺激HTF细胞增殖情况，找到最佳刺激浓度及最佳刺激时间用于实验研究。将实验分为三组，未刺激组（no treated）、阳性对照(TGFβ2刺激组)及实验组(TGFβ3刺激组），比较三组不同刺激HTF后，细胞增殖情况，计算TGFβ3刺激后的细胞生长抑制率。三组不同刺激组分别同时作用于HTF，分别提取三组HTF的总RNA，RT-PCR定性、Real-time PCR定量检测HTF细胞外基质中纤维连接蛋白（fibronectin，FN）、胶原蛋白Ⅰ(collagenⅠ)及胶原蛋白Ⅳ(collagenⅣ)基因水平，比较三组之间的基因表达的不同。同时，运用免疫组织化学染色检测三组HTF细胞外基质中FN、collagenⅠ及collagenⅣ的蛋白表达水平的差异
　　结果:
　　1.组织块贴壁后，第7天可见组织块周边贴壁爬出长梭形细胞，形态符合HTF的细胞形态特征。第2周可见组织块周围爬满长梭形细胞，传至第3代，可见细胞形态及生长速度稳定（图1）。
　　2.RT-PCR结果显示细胞中FN、兔抗人波形蛋白(Vmentin)基因水平表达阳性（图2）。细胞免疫荧光鉴定结果显示:兔抗人波形蛋白(Vimentin)抗体染色阳性。因此，由人眼Tenon's囊组织块原代培养出的细胞属成纤维细胞（图3）。
　　3.10ng/mlTGFβ3刺激HTF后，细胞增殖明显受抑制，且具有统计学意义(P=0.0023166，P＜0.05)，因此，选取10ng/ml作为TGFβ3的最佳刺激浓度(图6)。
　　4.1ng/mlTGFβ2刺激HTF后，细胞增殖明显增加，且具有统计学意义(P=0.0034119，P＜0.05)，因此选取1ng/ml作为TGFβ2的最佳刺激浓度（图4）。以1ng/ml TGFβ2刺激HTF，可看到前6天细胞数量均明显增加，直至第7天HTF生长开始下降，且在第1天时细胞大量生长，与未刺激时相比具有统计学意义（图5）。因此，选取1天作为刺激时间即可比较出细胞增殖变化。
　　5.1ng/ml TGFβ2刺激组与无刺激组相比，细胞明显增殖，具有统计学意义(P=0.0071722，P＜0.05)。10ng/ml TGFβ3刺激组与无刺激组相比，细胞增殖明显下降，具有统计学意义(P=0.0157，P＜0.05)。由此可见，TGFβ2与TGFβ3在HTF增殖方面影响明显，且可选取该浓度作为实验浓度（图7）。另外，TGFβ3刺激HTF后，细胞的生长抑制率为17.86％。
　　6.RT-PCR定性比较三组不同刺激HTF后的结果:10 ng/ml TGFβ3刺激组ECM中FN、collagenⅠ及collagenⅣα3、Ⅳα4、Ⅳα5、Ⅳα6基因表达水平降低，而collagenⅣα1、Ⅳα2的基因表达水平无明显变化（图8）。从Real-time PCR定量比较来看，结果与RT-PCR检测结果一致，10 ng/ml TGFβ3刺激组ECM中FN、collagenⅠ及collagenⅣα3、Ⅳα4、Ⅳα5、Ⅳα6基因表达水平降低，而collagenⅣα1、α2的基因表达水平无明显变化，且具有统计学意义(P值分别为0.0471、0.0007117、0.0087652、0.0043483、0.0028456、0.0145,P值均＜0.05)(图9)。
　　7.免疫组织化学从蛋白水平比较的结果显示:无刺激组、1 ng/ml TGFβ2刺激组（阳性对照）、10ng/ml TGFβ3刺激组（实验组）中FN、collagenⅠ及collagenⅣ均表达阳性，但TGFβ3刺激组中FN、collagenⅠ及collagenⅣ染色信号明显减弱，可看出蛋白水平下降（图10）。
　　结论:TGFβ3可抑制HTF增殖及ECM中成分的表达，推测TGFβ3可能在一定程度上起到抑制瘢痕形成的作用。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、原代培养HTF

1．1 对象和方法

1．1．1 实验对象

1．1．2 主要仪器、材料及试剂

1．1．3 实验方法

1．2 结果

1．2．1 Tenon’s囊成纤维细胞形态(将Tenon’s囊成纤维细胞放于倒置显微镜下拍照)

1．2．2．鉴定结果

1．3 讨论

1．3．1 HTF的原代培养

1．3．2 HTF的鉴定

1．4 小结

二、TGFβ3刺激HTF后细胞增殖的变化

2．1 对象和方法

2．1．1 实验对象

2．1．2 主要仪器、材料及试剂

2．1．3 实验方法

2．2 结果

2．2．1 不同浓度TGFβ3刺激HTF

2．2．2 不同浓度、不同时间TGFβ2刺激HTF细胞

2．2．3 不同刺激组刺激HTF后，细胞增殖情况

2．2．4 不同刺激下ECM成分的变化

2．3 讨论

2．3．1 TGFβ3刺激HTF

2．3．2 TGFβ2刺激HTF

2．3．3 不同刺激作用于HTF

2．3．4 不同刺激作用于HTF，细胞中ECM表达的变化

2．4 小结

结论

本论文的不足和进一步研究方向

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 眼部瘢痕形成过程中TGFβ与microRNA的相互作用

致谢