MEHP对原代培养新生大鼠下丘脑神经元的毒性作用

摘要

目的：
　　下丘脑是人体内的神经-内分泌高级调节中枢，在其发育的的关键时期，对内、外源性激素作用非常敏感。邻苯二甲酸单乙基己基酯(MEHP)是邻苯二甲酸二乙基己基酯(DEHP)的活性代谢产物，具有抗雄激素作用和拟雌激素作用，对下丘脑神经元的发育有可能产生干扰作用，但是相关研究少见报道。本研究通过体外试验探讨MEHP对新生大鼠的下丘脑神经元发育的干扰作用及其剂量反应关系模型;并通过MEHP对下丘脑神经元凋亡的影响，以及MEHP对雌激素/雄激素介导的神经元生长发育的影响，初步探讨其作用的途径及机制。
　　方法：
　　(1)新生大鼠下丘脑神经元原代培养方法及神经元鉴定:在原代培养的下丘脑神经元中，采用改良的机械吹打法制单细胞悬液，培养液选用添加10％去类固醇血清的DMEM培养液，培养24h后将培养液更换为97％Neurobasal+2％B27+1％Glutamine培养液，以抑制胶质细胞的过度增殖。采用神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学染色法鉴定下丘脑神经元;采用H-E染色、Nissl染色法染色以观察下丘脑神经元的形态学特点。
　　(2)不同浓度MEHP（10-15mol/L-10-3mol/L）处理培养7d的下丘脑神经元，作用24h、48h分别MTT法测定吸光度值并且计算细胞活力以及抑制率，建立MEHP对神经元生长抑制作用的剂量-反应关系模型;测量不同浓度MEHP对下丘脑神经元神经突长度、胞体面积以及突起个数的影响，观察其对神经元发育的影响。
　　(3)不同浓度MEHP处理神经元，Hoechst33258免疫细胞染色法分析神经元凋亡情况并计算凋亡率;不同浓度E2/T处理神经元，MTT法测定吸光度值并且计算细胞活力，确定适宜的E2/T浓度用于后续试验;不同浓度MEHP与雌二醇(E2，10-7mol/L)或睾酮(T，10-7mol/L)联合处理培养的下丘脑神经元，测量不同浓度MEHP与E2或T联合处理组对下丘脑神经元神经突长度、胞体面积以及突起个数的影响，观察其对神经元发育的影响，并且，用Hoechst33258免疫细胞染色法分析不同浓度MEHP与E2或T联合处理组对神经元凋亡情况的影响并计算凋亡率。
　　结果：
　　(1)本研究原代培养的下丘脑神经元纯度可达到95％以上，并且神经元生长发育良好。(2)下丘脑神经元在不同浓度MEHP中处理24h后，10-15mol/L、10-13mol/L、10-11mol/L、10-9mol/L、10-7mol/L、10-5mol/L、10-3mol/L折光性变差，胞体变小，神经突变短神经元突触之间的连接断裂。10-15mol/L、10-3mol/L MEHP组抑制率分别为30.1％和33.6％，均对神经元的生长具有明显的抑制作用，而10-9mol/LMEHP组抑制率为1.6％，对神经元的生长的抑制作用不明显，MEHP不同处理组对下丘脑神经元的抑制作用呈U型剂量-反应关系曲线。(3)MEHP处理过的细胞，染色质皱缩，呈现不规则形状，有凋亡小体出现。MEHP处理组与对照组比较凋亡率增加，且差异均具有统计学意义（P＜0.05），10-3mol/LMEHP组凋亡率最高，为83.98％。(4)不同浓度E2/T处理组对神经元均具有促进生长作用，经过比较，本研究选取10-7mol/LE2/T作为后续试验的终浓度。(5)不同浓度MEHP与E2/T(10-7mol/L)联合处理培养的下丘脑神经元，对下丘脑神经元神经突的长度以及胞体面积均有不同程度的减少。与E2/T组比较发现，MEHP拮抗E2/T介导的下丘脑神经元的增殖作用。(6)10-7mol/L、10-5mol/L、10-3mol/L MEHP+E2/T(10-7mol/L)处理组凋亡率分别为27.97％、42.8％、68.66％，与对照组比较，差别均具有统计学意义(P＜0.05)。MEHP拮抗E2/T介导的下丘脑神经元的抗凋亡作用。
　　结论：
　　本研究结果表明，MEHP可抑制下丘脑神经元的增殖，MEHP对下丘脑神经元的影响存在非单调性的剂量-反应关系。MEHP对下丘脑神经元具有直接致凋亡作用，MEHP拮抗性激素E2/T介导的下丘脑神经元的增殖作用及抗凋亡作用，但是其作用机制还有待进一步研究。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

技术路线图

第一部分 新生雄性SD大鼠下丘脑神经元的原代培养

1．1 对象和方法

1．1．1 仪器与试剂

1．1．2 实验方法

1．1．3 统计学处理

1．2 结果

1．2．1 神经元生长情况

1．2．2 神经元鉴定

1．3 讨论

1．4 小结

第二部分 MEHP对原代培养下丘脑神经元活力及发育的影响

2．1 对象与方法

2．1．1 仪器与试剂

2．1．2 实验方法

2．1．3 统计学处理

2．2 结果

2．2．1 MEHP对下丘脑神经元形态的影响

2．2．2 MEHP对下丘脑神经元活力的影响

2．2．3 MEHP对下丘脑神经元生长发育的影响

2．3 讨论

2．4 小结

第三部分 MEHP对下丘脑神经元发育影响的机制探讨

3．1 对象与方法

3．1．1 仪器与试剂

3．1．2 实验方法

3．1．3 统计学处理

3．2 结果

3．2．1 MEHP对原代培养下丘脑神经元凋亡的影响

3．2．2 性激素E2／T对下丘脑神经元生长发育的影响

3．2．3 MEHP对E2／T介导的促神经元增殖作用的影响

3．2．4 MEHP对E2／T介导的下丘脑神经元抗凋亡作用的影响

3．3 讨论

3．4 小结

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 邻苯二甲酸酯的神经发育毒性研究进展

致谢