富氢液在调节单核细胞黏附和内皮通透性中的作用及机制研究

摘要

目的:脓毒症是由各种感染因素引起的全身炎性反应为主的综合征，由于发病机制复杂，尚无有效治疗方法。脓毒症患者死亡的一个重要病理过程就是内皮细胞通透性的增加，各种黏附分子和趋化因子调节单核细胞向内皮迁徙、黏附、积聚，最终破坏内皮细胞，使其通透性增加。而血管内皮钙粘蛋白(VE-cadherin)是血管内皮细胞特异性粘连蛋白，参与形成正常细胞间的连接，调节血管内皮间的通透性。近几年的研究结果表明氢气具有选择性抗氧化和抗炎作用，是有效的自由基清除剂，可应用于多种疾病的治疗研究。本实验拟采用LPS诱导的血管内皮细胞损伤模型，探讨富氢液在调节单核细胞黏附及血管内皮细胞屏障通透性中的作用及相关机制。
　　方法:人脐静脉内皮细胞株HUVEC-12和人单核细胞株U937复苏后分别用于实验研究。
　　第一部分:分为正常对照组（N组）;富氢液组（H2组），0.6mmol/L饱和含氢培养液培养;LPS组和LPS+H2组。后两组分别加入1μg/mL LPS。待内皮细胞融合成单层后的6、12和24 h，分别加入U937，共培养90min后，瑞姬氏染色观察细胞黏附情况，ELISA法测定细胞上清液VCAM-1和E-selectin的浓度，用跨内皮细胞电阻(TEER)检测内皮通透性，Western Blot法检测VE-cadherin的表达，免疫荧光法检测VE-cadherin的分布。
　　第二部分:分为正常对照组（N组），LPS组，LPS+H2组，LPS+Y-26732(10μmol/L)组和LPS+Y-26732(20μmol/L)组，其中Y-27632是ROCK蛋白抑制剂，进行内皮通透性的检测，收集细胞上清液和蛋白，用ELISA法分别检测黏附分子VCAM-1和E-selectin水平，Western Blot法测定钙粘蛋白VE-cadheri水平及ROCK蛋白浓度。
　　结果:第一部分:相比对照组，LPS可刺激单核细胞黏附于内皮细胞，黏附分子浓度显著升高，内皮细胞的TEER值显著降低，细胞VE-cadherin蛋白表达量明显减少，呈时间依赖性降低，荧光结果显示正常细胞VE-cadherin围绕在细胞周边，形成连续的单层屏障，LPS组VE-cadherin在细胞连接处分布不完整。相比LPS组，LPS+H2组单核细胞黏附减少，黏附分子浓度降低，细胞TEER值增加，VE-cadherin蛋白表达量明显增加，VE-cadherin在细胞连接处较完整，分布均匀。
　　第二部分:LPS组黏附分子水平升高，细胞TEER值显著降低，VE-cadherin含量降低，而ROCK蛋白表达增多，与LPS组相比，LPS+H2组的黏附分子减少，TEER值升高，VE-cadherin蛋白水平升高，ROCK蛋白表达下降。ROCK抑制剂Y-26732表现出与富氢液组相似的结果，黏附分子水平降低，TEER值升高，VE-cadherin浓度增加，ROCK蛋白表达减少，高浓度的Y-27632相比低浓度表现出更好的内皮通透性保护作用。
　　结论:富氢液可以减轻LPS诱导的单核细胞黏附血管内皮细胞，减少黏附分子的释放;可以改善LPS对血管内皮细胞通透性的破坏，增加细胞间钙粘蛋白的表达;其机制可能与改善ROCK介导黏附连接蛋白VE-cadherin的表达和分布有关，发挥对血管内皮细胞通透性的调节。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

第一部分 富氢液对LPS诱导单核细胞黏附及内皮通透性的影响

1．1 实验材料

1．1．1．实验细胞及器材

1．1．2 主要试剂

1．1．3 主要液体及其配置

1．2 实验方法

1．2．1 细胞培养

1．2．2 富氢液的制备

1．2．3 分组及处理

1．2．4 统计学处理

1．3 结果

1．4 讨论

第二部分 富氢液通过ROCK发挥对LPS诱导单核细胞黏附和血管内皮屏障破坏的保护作用

2．1 实验材料

2．1．1 实验细胞及器材

2．2．2 主要试剂

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 富氢液的制备

2．2．3 分组及处理

2．2．4 统计学处理

2．3 结果

2．4 讨论

结论

创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 炎症反应下白细胞与内皮细胞的黏附

致谢