MiR-145在原发性膝关节骨性关节炎软骨中的表达及其意义

摘要

研究目的：
　　探讨miR－145在原发性膝关节骨性关节炎软骨中的表达及其对正常软骨细胞的生物学作用，从而为探讨其在骨性关节炎中的作用机制奠定基础。
　　研究方法：
　　收集原发性膝关节骨性关节炎20例和正常膝关节的关节软骨10例，对软骨进行细胞培养，并根据改良的Mankin评分标准对骨性关节炎关节软骨进行分组。应用免疫组化的方法检测miR－145在各组软骨组织中的表达；使用RT-PCR方法检测各组软骨组织中miR－145的表达，应用RT-PCR方法检测软骨细胞中MMP13、X型胶原、RNAK、碱性磷酸酶mRNA的表达，western blot检测软骨细胞中MMP13、X型胶原、RANK、碱性磷酸酶的蛋白表达；所有数据均应用SPSS19.0软件进行统计学分析。
　　通过生物信息分析技术分析软骨细胞中miR-145的靶向调控基因表达差异，寻找软骨与miR－145共表达基因，并验证。通过Lipofectamine?2000试剂将其转染软骨细胞，通过RT-PCR检测软骨细胞中相关基因的表达量，westernblot检测软骨细胞中相关蛋白的表达量。通过干扰TNFRSF11B，探索其对miR－145抑制的软骨细胞胶原蛋白表达的影响。
　　研究结果：
　　MiR－145在正常膝关节和原发性膝关节骨性关节炎的关节软骨中均有表达,其主要位于软骨细胞的胞浆中，RT-PCR结果显示miR－145的表达在骨性关节炎软骨组织中明显低于正常膝关节的关节软骨(P<0.05)，western blot的结果同样提示原发性骨性关节炎软骨细胞中miR－145蛋白含量均显著低于正常膝关节软骨(P<0.05)，而且随着骨性关节炎严重程度的提高，miR－145的表达、蛋白含量逐步降低，在重度骨性关节炎软骨中这些差异都具有统计学意义(P<0.05)。
　　为了进一步探讨miR－145对正常软骨细胞生物学的影响，我们成功将其转染至培养的软骨细胞，RT-PCR和western blot对软骨细胞进行检测分析，结果显示：MMP13、Collagen X胶原纤维蛋白受到抑制；大剂量时（100nM），RANK蛋白表达受到抑制，对ALP的作用不明显；但上述抑制并不依赖于miR－145的浓度。
　　对GSE17785表达普芯片进行分析，骨关节炎相关基因为732个，miR－145相关基因有192个，同时与软骨相关和miR－145相关的基因有13个；在miR－145过表达质粒转染软骨细胞后，对关键基因蛋白TNFRSF11B进行检测，结果表明，随着miR－145浓度增加，TNFRSF11B蛋白表达降低。正常关节软骨与不同退变程度的骨关节炎（轻度、中度及重度），其软骨组织中TNFRSF11B表达随着退变程度加重，表达水平增高。方差分析显示，TNFRSF11B在正常组织中表达最低，在重度退变软骨中呈高表达，与其余三组的差异有统计学意义（P<0.01），而在轻度和重度退变的组织中表达差异无统计学意义（P>0.05）。关节软骨细胞经TNF－a诱导处理，检测其中TNFRSF11B基因表达，验证软骨细胞中TNFRSF11B基因变化，结果显示，TNFRSF11B在骨关节炎软骨细胞中高表达，在正常软骨细胞中低表达。对软骨细胞TNFRSF11B进行干扰，并进行miR－145过表达质粒转染，检测细胞中与软骨相关的蛋白的表达，研究结果表明，MMP13和ALP蛋白变化趋势不明显，RANK蛋白变化明显，collagen X和TNFRSF11B蛋白明显增加。
　　研究结论：
　　1、原发性膝关节骨性关节炎的软骨中 miR－145的表达较正常软骨显著降低，并且软骨退变程度越重，miR－145表达亦越低；
　　2、miR－145可以抑制软骨细胞MMP13、X型胶原、RANK的表达；
　　3、miR－145靶向调控TNFRSF11B；
　　4、TNFRSF11B在关节软骨中高表达；
　　5、干扰TNFRSF11B可以rescue miR－145抑制的软骨细胞胶原蛋白表达。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、miR-145在骨关节炎组织及在TNF-a处理的软骨细胞中的表达水平测定

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、miR-145对软骨细胞胶原纤维表达的作用

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

三、miR-145 靶向调控TNFRSF11B

3.1对象和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

四、干扰TNFRSF11B对miR-145抑制的软骨细胞胶原蛋白表达的影响

4.1对象和方法

4.2结果

4.3讨论

4.4小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述: 骨性关节炎发病机制与 microRNA 基因表达调控

致谢