Rac1蛋白在胶质瘤中的表达及其促进胶质爱情的代价瘤细胞运动机制的研究

摘要

胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme, GBM）是中枢神经系统最常见、侵袭性最强的恶性胶质瘤，属人类难治性和预后极差的肿瘤之一。尽管采用规范的标准化治疗，但胶质母细胞瘤患者预后改善甚微。即使肿瘤实现影像学全切，但胶质母细胞瘤术后常常复发于肿瘤周围2cm范围[1-3]。临床和病理学证据表明胶质瘤细胞常常沿着细长的解剖结构浸润播散，如脑白质纤维束、微血管和无髓鞘轴突[4]。胶质母细胞瘤侵袭迁移的特性是其不良预后的主要原因。因此，越来越多的人意识到靶向抑制调控胶质瘤侵袭迁移的分子将为胶质瘤的治疗提供新方法。
　　胶质瘤细胞的迁移侵袭是一个完整和复杂的多步骤过程，其发生侵袭需要4个基本步骤，包括①.肿瘤细胞脱离肿瘤实体；②.与细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的黏附；③.在基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)等作用下降解ECM；④.细胞运动和收缩。在这些步骤中，最为关键的环节为细胞的迁移运动。作为重要的信号分子，肌动蛋白骨架及其调控蛋白在胶质瘤细胞的运动中发挥了重要作用[5,6]。Rac1为Ras相关的C3肉毒素底物1的简称，其基因全长29 kb，包含7个外显子，位于人染色体7p22，参与Ras基因的恶性转型。Rac1作为Rho家族成员之一，存在Rac1-GDP（失活状态）和Rac1-GTP（激活状态）两种形式,是细胞内多条信号转导通路的关键分子。Rac1作为分子开关参与调节一系列的细胞功能,包括细胞增殖、凋亡，肿瘤细胞的侵袭迁移等。片状伪足的形成和黏着斑的周转作为细胞迁移的两个关键步骤，在细胞的迁移中发挥重要作用。Rac1不仅参与细胞片状伪足的形成，而且参与黏着斑的周转调节，被认为是调控肿瘤细胞侵袭迁移的关键因子。相关研究表明，Rac1在上皮性卵巢癌、胃癌、肝细胞癌等肿瘤中过表达并与肿瘤恶性进展密切相关[7-9]。
　　本课题主要研究Rac1在胶质瘤中的表达及其促进胶质瘤细胞运动机制的研究，包括三个部分：
　　1.人胶质瘤组织中Rac1的表达。为研究胶质瘤中Rac1的表达及其与胶质瘤病理分级的相关性，40例各级别的胶质瘤标本以及8例对照脑组织被用于实验研究。首先，我们运用免疫组化检测Rac1在不同标本中的表达，结果证实，Rac1在对照脑组织中不表达，而在胶质瘤组织标本中其染色强度随着肿瘤级别的升高而增强(F=105.225，P=0.000)。
　　接下来，蛋白免疫印迹实验被用于进一步半定量评估 Rac1在各组织中的表达，结果为对照脑组织中Rac1的表达量为0.093±0.025(n=8)，而WHO II、WHO III和WHO IV级胶质瘤标本中Rac1表达量分别为0.22±0.031(n=8)，0.38±0.031(n=12)，0.61±0.025(n=20)。统计学结果表明，相比于对照脑组织，Rac1在胶质瘤中表达量升高（P<0.01），且与胶质瘤的病理分级呈正相关（r=0.92, P=0.012）。
　　2. Rac1在胶质瘤细胞迁移和侵袭中的作用。我们使用Rac1的特异性的小分子抑制剂NSC23766下调Rac1的活性，探讨Rac1对胶质瘤细胞侵袭迁移的影响。U251和 SNB19细胞系用于体外实验研究,实验分为2组，即 control组和NSC23766处理组。GST pull-down实验检测Rac1活性，MTT实验检测NSC23766对胶质瘤细胞活性的影响；Transwell侵袭实验和划痕实验分别用于检测细胞的侵袭和迁移能力。结果：Rac1的活性被明显抑制（P<0.01），抑制Rac1的活性后胶质瘤细胞的迁移侵袭能力明显下降（P<0.01）。
　　3. Rac1促进胶质瘤细胞迁移和侵袭的可能机制。为探究Rac1促进细胞运动的机制，Rac1的小分子抑制剂NSC23766和Rac1特异性的小干扰RNA两种方法被用于体外实验研究。细胞免疫荧光观察细胞形态的变化及 Rac1与 LIMK1在细胞内的定位。Western blotting验证control、siRNA-NC和Rac1siRNA组Rac1的表达情况。Western blotting检测不同处理组P-LIMK1（Thr508）、LIMK1、MMP-2和MMP-9的表达变化。划痕实验和Transwell侵袭实验评价control、Rac1siRNA和 LIMK1siRNA组细胞迁移、侵袭能力的变化。结果：与 control组相比， NSC23766处理组细胞片状伪足明显变小甚至不伸展，此外，NSC23766抑制黏着斑的周转，抑制 LIMK1的磷酸化（P<0.01）。Western blotting结果显示， Rac1siRNA能明显下调Rac1蛋白的表达。相应地，沉默Rac1的表达可得到相似的结果。免疫荧光结果显示Rac1与LIMK1共定位于细胞前缘的片状伪足处。抑制Rac1的活性后MMP-2、MMP-9的表达明显下调（P<0.01）。与control组相比，Rac1siRNA与LIMK1siRNA组细胞迁移和侵袭能力明显下降（P<0.01）。
　　结论：
　　1.与对照脑组织相比，Rac1在胶质瘤组织中的表达明显升高，且与胶质瘤病理级别呈正相关。
　　2. Rac1在胶质瘤细胞的侵袭和迁移中发挥重要作用。
　　3.Rac1通过调节片状伪足的形成，黏着斑的周转和基质金属蛋白酶-2和-9（MMP-2、MMP-9）的表达参与调控胶质瘤细胞的迁移和侵袭。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、Rac1蛋白在不同级别胶质瘤中的表达情况

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4 小结

二、Rac1蛋白在胶质瘤细胞迁移和侵袭中的作用

2.1对象和方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4小结

三、Rac1蛋白促进胶质瘤细胞迁移和侵袭的可能机制

3.1对象和方法

3.2 结果

3.3讨论

3.4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:Rac信号与肿瘤发生

致谢