胱氨酸谷氨酸转运蛋白调节乳腺癌细胞转移的作用机制研究

摘要

目的：
　　第一部分：胱氨酸谷氨酸转运蛋白(xCT)是氨基酸转运系统的功能性亚基，细胞膜上 xCT的表达与细胞摄取胱氨酸关系密切，而胱氨酸是细胞内合成谷胱甘肽(GSH)所必不可少的，对维持细胞内谷胱甘肽水平起着重要的作用。GSH是细胞内重要的抗氧化剂，在维持细胞内氧化还原平衡中起重要作用。Sut突变小鼠，是经典的Hermansky Pudlak综合症小鼠模型，在sut细胞中，由于编码xCT蛋白的Slc7a11基因的突变，编码的蛋白变为xCT-sut，其C-端的9个氨基酸替代了野生型xCT的C-端20个氨基酸。我们前期的研究发现xCT缺陷能够抑制sut细胞的生长，并通过JNK信号通路触发细胞凋亡，但通过流式细胞仪分析发现凋亡细胞只占死亡细胞的一部分，其他死亡细胞是通过何种途径死亡的还不清楚。因此我们选取xCT缺陷的小鼠黑色素细胞sut作为研究对象，在前期工作的基础上进一步探讨xCT缺陷诱导细胞死亡的机制。
　　第二部分：乳腺癌是全球女性最常见的癌症之一，在过去20年中大多数国家的发病率持续增长。癌细胞的转移性是乳腺癌高致死率的首要原因，癌细胞易发生转移，手术治疗的效果并不能令人满意。因此了解癌细胞转移的机制是降低癌症患者死亡率的重要因素。近年来研究发现 xCT在多种高转移癌细胞中表达升高，我们在前期研究中也发现xCT在乳腺癌、肝癌和黑色素瘤中高表达。但其与乳腺癌转移的关系尚未报道，因此本研究旨在探讨 xCT在乳腺癌转移过程中的作用及其机制。
　　方法：
　　第一部分：为确定 sut细胞是否发生自噬，我们采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法检测了自噬相关基因 ATG5、ATG7、ATG12的表达，采用Western blot方法检测了自噬标志物LC3-I、LC3-II以及Beclin1蛋白的表达；为确定xCT缺陷是否通过内质网应激途径诱导sut细胞发生自噬性死亡，我们检测了由内质网应激激活的主要信号转导通路中关键分子ATF6以及IRE1-XBP1的表达；然后用Western blot方法检测了Akt/mTOR/p70S6K信号通路中关键蛋白质磷酸化水平的改变，确定Akt/mTOR/p70S6K是否参与xCT缺陷诱导的自噬；最后，用p38 MAPK抑制剂SB203580处理sut细胞，以探讨p38MAPK信号通路对xCT诱导的自噬的影响。
　　第二部分：我们对人类高转移乳腺癌细胞株 MDA-MB-231转染入SLC7A11-RNAi质粒，敲降xCT，然后利用细胞划痕实验和Transwell实验检测xCT敲降后，MDA-MB-231迁移及侵袭能力的改变。利用Western Blot和RT-PCR方法检测其自噬相关标志物 LC3-I，LC3-II，EMT(上皮细胞间质化)过程相关标志物E-cadherin、Vimentin以及转录因子Snail表达水平的改变。确定EMT是否参与乳腺癌细胞MDA-MB-231的转移，以及xCT是否通过自噬途径参与乳腺癌细胞MDA-MB-231的转移。
　　结果：
　　第一部分：
　　1.通过电子显微镜观察，发现xCT缺陷导致sut细胞中出现了脂滴和自噬体；在xCT缺陷的sut细胞中，自噬相关基因ATG5、ATG7、ATG12的表达升高，自噬相关标志物LC3-II/LC3-I的比值升高，Beclin1蛋白的表达上调；自噬抑制剂3-MA处理sut细胞48h后观察到细胞死亡数量减少。
　　2.在xCT缺陷的sut细胞中，内质网应激激活的主要信号转导通路中关键分子ATF6的裂解胞质片段(ATF6f)迅速产生，但没有检测到XBP1的裂解片段。
　　3.在xCT缺陷的sut细胞中检测到Akt在Thr308位点、mTOR在Thr2481位点、p70S6K在Thr389位点的磷酸化水平降低。
　　4.苯基丁酸能够促进蛋白折叠以及抑制内质网应激，在xCT缺陷的sut细胞中加入苯基丁酸后，发现Akt在Thr308位点、mTOR在Thr2481位点、p70S6K在Thr389位点的磷酸化水平升高，苯基丁酸的加入抑制了LC3I向LC3II转换。
　　5.在xCT缺陷的sut细胞中，p38 MAPK，ERK磷酸化水平升高，核转录因子NF-κB的表达水平升高；加入p38 MAPK抑制剂SB203580显著抑制了Beclin1的表达升高；加入苯基丁酸抑制了p38 MAPK磷酸化水平及ERK磷酸化水平。
　　第二部分：
　　1.人类低转移乳腺癌细胞MCF-7中xCT的表达明显低于人类高转移乳腺癌细胞MDA-MB-231。
　　2.敲降xCT后的MDA-MB-231细胞，与对照组相比，细胞划痕的愈合速度明显减慢，穿膜细胞明显减少。
　　3.敲降 xCT后，上皮细胞标志物 E-cadherin的表达升高，间质细胞标志物 Vimentin的表达降低；敲降xCT前后，MDA-MB-231细胞中转录因子Snail的mRNA水平没有明显的变化，而Snail的蛋白水平降低。
　　4.敲降xCT后，MDA-MB-231细胞中LC3-II／LC3-I的比值增高。
　　结论：
　　第一部分：
　　xCT缺陷能够诱导sut细胞发生内质网应激和自体吞噬。内质网应激通过激活p38 MAPK信号通路进而抑制Akt/mTOR/p70S6K信号通路，从而介导了xCT缺陷诱导的自噬，最终导致sut细胞的自噬性死亡。
　　第二部分：
　　xCT在人类高转移乳腺癌细胞MDA-MB-231中高表达。敲降xCT的表达可以使人类高转移乳腺癌细胞MDA-MB-231发生自噬，降解转录因子Snail，从而抑制EMT，降低人类高转移乳腺癌细胞MDA-MB-231的转移能力。

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缩略语/符号说明

一、xCT缺陷诱导sut细胞自噬性死亡的作用机制研究

1.1前言

1.1.1研究现状、成果

1.1.2研究目的、方法

1.2对象和方法

1.2.1实验对象

1.2.2 实验仪器及实验试剂

1.2.3 实验方法

1.3结果

1.3.1 xCT缺陷诱导sut细胞发生自噬及自噬性死亡

1.3.2 xCT缺陷诱导sut细胞发生内质网应激

1.3.3 sut细胞中Akt/mTOR/p70S6K信号通路参与诱导自噬

1.3.4 内质网应激通过Akt/mTOR/p70S6K信号通路调节自噬和自噬性细胞死亡

1.3.5 sut细胞中p38 MAPK信号通路参与内质网应激诱导的自噬

1.4讨论

1.5小结

二、xCT调节乳腺癌细胞转移的作用机制研究

2.1前言

2.1.1研究现状、成果

2.1.2研究目的、方法

2.2对象和方法

2.2.1实验对象

2.2.2实验仪器与实验试剂

2.2.3 实验方法

2.3结果

2.3.1 xCT的表达与人类乳腺癌细胞的转移能力相关

2.3.2敲降xCT可以降低人类高转移乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移能力和侵袭能力

2.3.3 Snail参与xCT对EMT的调控过程

2.3.4 降低xCT的表达可使人类高转移乳腺癌细胞发生自噬进而降解Snail

2.4讨论

2.5小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:自噬与肿瘤的关系

致谢