TLR7激动剂CL097对实验性自身免疫性葡萄膜炎中Th17细胞的影响

摘要

研究目的：
　　人类自身免疫性葡萄膜炎是一类严重的炎症性致盲眼病，近年研究认为辅助性T淋巴细胞17（Th17）与自身免疫性疾病的发生发展密切相关，在一些自身免疫性疾病的发展过程中Toll样受体7（TLR7）可以影响Th17细胞的分化，但TLR7在实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）中是否可以通过树突状细胞（DCs）调控Th17细胞的作用机制还未见报道。CL097是一种能够活化TLR7的激动剂，本研究主要探究TLR7激动剂CL097处理的小鼠骨髓树突状细胞（BMDCs）对EAU中光感受器间维生素A类结合蛋白（IRBP）1-20-特异性Th17细胞的影响，并初步探讨其可能的分子机制。
　　方法：
　　首先通过体外重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）及重组小鼠白细胞介素（rmIL）-4（rmIL-4）定向诱导 BMDCs，并应用流式细胞仪鉴定BMDCs。第6天向BMDCs中加入5μg/ml CL097作用8h，对照组加入等体积 PBS，采用实时荧光（RT）-PCR技术检测 CL097处理组与对照组 BMDCs中IL-6，IL-23，IL-1β以及转化生长因子（TGF）-β（TGF-β）mRNA的相对表达量。将IRBP1-20多肽片段与等体积含有结核杆菌素H37RA的弗氏完全佐剂（CFA）混合并充分乳化后主动免疫 C57BL/6小鼠，利用间接检眼镜观察小鼠眼底炎症表现，并参照Caspi评分标准进行炎症评分。免疫后第13天取C57BL/6小鼠的眼球制作病理切片，并用苏木精-伊红染色后进行组织病理学检查。同时分离得到C57BL/6小鼠脾脏及淋巴结中IRBP1-20-特异性T细胞，并与CL097处理组及对照组BMDCs共培养至第5天，收集细胞。采用RT-PCR技术检测IL-17，γ干扰素（IFN-γ），维甲酸受体相关孤儿受体（ROR）γt（RORγt）和T盒21转录因子（T-bet）mRNA的相对表达量以及采用流式细胞仪检测 Th1及 Th17细胞的比率变化。将培养至第6天得到的高纯度 BMDCs随机分为6组，并用CL097分别处理0h、0.25h、0.5h、1h、3h、6h，之后利用western blot检测各组BMDCs中p-p38，p-ERK1/2，p-JNK的蛋白表达量。
　　结果：
　　1、定向诱导BMDCs的第6天，流式细胞仪鉴定结果显示BMDCs纯度可达90％。
　　2、RT-PCR检测结果显示，BMDCs经CL097处理后IL-6、IL-23、IL-1βmRNA相对表达量较对照组显著升高（t=4.560，P=0.045；t=5.476，P=0.032；t=17.24，P=0.003），差异均有统计学意义，TGF-β mRNA相对表达量较对照组显著降低（t=10.41，P=0.009），差异有统计学意义。
　　3、主动免疫后第13天成功建立小鼠EAU模型。
　　4、流式细胞仪检测证实CL097处理组BMDCs与IRBP1-20-特异性T细胞共培养后第5天，与对照组相比，Th17细胞比例由（10.240±3.173）%升至（17.750±4.793）%（t=4.938，P=0.039），差异有统计学意义（t=4.938，P=0.039）。但Th1细胞比例为（1.123±0.356）%，较对照组（1.060±0.384）%基本无变化，差异无统计学意义(t=2.714，P=0.113)。
　　5、RT-PCR检测结果显示，CL097处理组BMDCs与IRBP1-20-特异性T细胞共培养后第5天，与对照组相比，RORγt和IL-17 mRNA的相对表达量明显升高（t=8.844，P=0.013；t=8.831，P=0.013），差异均有统计学意义，而T-bet，IFN-γmRNA相对表达量基本变化不大(t=2.078，P=0.173；t=1.082，P=0.393)，差异均无统计学意义。
　　6、western blot结果显示经CL097刺激后，BMDCs中p-p38的蛋白表达量仅在0.25h较对照组0h显著升高，之后恢复至0h水平；p-ERK1/2在0.25h、0.5h表达显著升高后又恢复至0h水平；p-JNK在0.25h、0.5h、1h表达显著升高后又恢复至0h水平。
　　结论：
　　1、在体外，TLR7激动剂CL097能够影响BMDCs分泌与Th17细胞极化相关的细胞因子，并间接促进EAU中Th17细胞的分化。
　　2、TLR7激动剂CL097可能是通过活化BMDCs中MAPKs(p38、ERK1/2和JNK)信号通路来间接促进EAU中Th17细胞的分化。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

1.1 实验动物与材料

1.1.1 实验动物

1.1.2实验主要仪器设备Cs137照射仪

1.1.3实验主要试剂BCA蛋白定量试剂盒

1.1.4实验主要试剂配制

1.2方法

1.2.1小鼠BMDCs的制备

1.2.2小鼠BMDCs总RNA提取

1.2.3测小鼠BMDCs总RNA的浓度

1.2.4小鼠BMDCs总RNA逆转录

1.2.5 RT-PCR

1.2.6 EAU模型的建立

1.2.7 IRBP1-20-特异性T细胞的制备

1.2.8 IRBP1-20-特异性T细胞与BMDCs共培养

1.2.9 RT-PCR检测共培养的IRBP1-20-特异性T细胞相关基因变化

1.2.10 流式细胞仪检测Th17和Th1细胞的比率

1.2.11细胞蛋白样品的制备

1.2.12 BCA法测定蛋白浓度

1.2.13 western blot检测p-p38、p-ERK1/2以及p-JNK

1.2.14统计学处理

1.3结果

1.3.1 BMDCs形态学观察与鉴定

1.3.2 EAU模型的鉴定

1.3.3 各组BMDCs分泌与Th17细胞极化相关基因mRNA的表达变化

1.3.4各组BMDCs对Th17及Th1细胞分化的影响

1.3.5 共培养后，与Th17及Th1细胞相关基因mRNA的表达变化

1.3.6 CL097刺激后BMDCs后p-p38、p-ERK1/2及p-JNK表达情况

1.4讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: miRNA在葡萄膜疾病中的作用研究进展

致谢