基于DNA甲基化途径叶酸对阿尔茨海病模型作用机制的研究

摘要

目的：
　　阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）的病理特征是细胞外淀粉样蛋白（amyloid-βpeptide，Aβ）沉积，以及神经细胞内高磷酸化tau蛋白形成神经纤维节缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）。AD的发生与多种营养素缺乏有关，叶酸作为一碳单位供体参与一碳单位代谢，进而参与体内多种甲基化过程，包括DNA甲基化和蛋白质甲基化等。而一碳单位代谢异常可增加哺乳动物脑海马区Aβ沉积，改变tau蛋白磷酸化水平。异常的DNA和蛋白质甲基化可能是与AD病理机制相关的表观遗传学机制。该研究将探讨叶酸通过DNA甲基化途径对AD模型的作用机制，为叶酸防治AD提供科学依据和新的思路。
　　方法：
　　采用三种AD细胞模型和APP/PS1双转基因小鼠AD模型研究叶酸对AD模型的作用机制。三种细胞模型分别为稳定转染APP695的小鼠N2a细胞，Aβ低聚物诱导的神经元细胞损伤模型和磷酸酯酶抑制剂诱导损伤的人神经母细胞（SH-SY5Y）瘤模型。分别模拟基因异常以及AD细胞内和细胞外病理机制。体内实验采用APP/PS1双转基因小鼠，对体外实验结果加以验证。
　　体外实验采用不同浓度叶酸（2.8-40μmol/L）孵育N2a-APP细胞96 h，并于细胞中添加甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）阻断剂，检测各组细胞甲基化潜能，DNMT活性，APP，PS1和Aβ的表达。不同浓度叶酸干预由Aβ低聚物造成细胞AD样损伤的原代培养大鼠海马神经元细胞和小鼠神经元HT-22细胞96 h，检测各组细胞DNMT活性，APP和PS1的表达，以及细胞活力。不同浓度叶酸（0-40μmol/L）作用于由磷酸酶抑制剂（okadaic acid，OA）（10 nmol/L）孵育的人神经母细胞瘤（human neuroblastoma cells，SH-SY5Y）96 h。检测叶酸对tau蛋白磷酸化的影响。
　　体内实验采用七月龄APP/PS1双转基因AD小鼠模型检测叶酸干预后动物脑内Aβ的表达状况。APP/PS1双转基因小鼠饲喂叶酸缺乏饲料或普通饲料，并灌胃叶酸和/或S-腺苷蛋氨酸（s-adenosylmethionine，SAM），采用免疫组化、western blot和RT-pcr法检测APP，PS1和Aβ的表达；采用高效液相色谱法检测肝脏组着和脑组织中SAM和SAH的表达；采用焦磷酸测序法检测APP、PS1基因的甲基化水平。
　　结果：
　　叶酸干预N2a-APP细胞实验结果显示，叶酸提高APP转基因细胞甲基化潜能，DNMTs基因和蛋白表达水平及其活性，提高APP和PS1甲基化水平。进而，叶酸降低APP基因表达，PS1基因和蛋白表达，降低Aβ蛋白表达，同时抑制DNMT活性后Aβ蛋白表达增加。
　　叶酸干预神经元细胞的实验结果显示，Aβ低聚物降低神经元细胞DNMT活性，增加PS1和APP表达，并降低细胞活力。补充叶酸后神经元细胞甲基化潜能和DNMT活性提高，PS1和APP基因启动子区甲基化水平增高，降低PS1和APP表达，并提高细胞活力。
　　而OA孵育的SH-SY5Y细胞tau蛋白Ser396位点高磷酸化，叶酸添加可抑制tau蛋白磷酸化，最大抑制剂量为40μmol/L。叶酸通过抑制去甲基化PP2A降低tau蛋白磷酸化。高叶酸（20和40μmol/L）可增加细胞活力和细胞甲基化潜能。
　　体内实验结果表明，转基因小鼠灌胃叶酸60天后，血清叶酸水平明显升高，但是灌胃SAM不能明显提高血清叶酸水平。叶酸缺乏可降低动物肝脏中SAM浓度，但对SAH的影响不明显。灌胃叶酸可提高小鼠脑内DNMT活性，改变APP，PS1基因启动子区甲基化水平。叶酸缺乏可增加转基因小鼠脑内海马区APP，PS1和Aβ表达水平，灌胃叶酸可降低上述蛋白表达水平。
　　结论：
　　体内、体外研究结果显示，叶酸对AD的作用机制，一方面可通过提高细胞甲基化潜能和调节DNMT酶活性，使APP和PS1基因甲基化并静默，进而减少Aβ蛋白蓄积，抑制Aβ低聚物对神经元细胞的毒性；另一方面叶酸可改变PP2A甲基化，进而影响tau蛋白磷酸化，从而抑制tau蛋白的异常磷酸化。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、叶酸对APP转基因细胞模型Aβ形成的影响及机制研究

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、叶酸对外源性Aβ诱导体外培养神经元细胞损伤的保护作用及机制研究

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

三、叶酸对SH-SY5Y细胞高磷酸化tau蛋白形成的影响及机制研究

3.1对象和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

四、叶酸对双转基因小鼠脑内Aβ形成的影响及机制研究

4.1对象和方法

4.2结果

4.3讨论

4.4小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 阿尔茨海默病相关膳食因素研究

致谢