用代谢组学方法研究DNA甲基化对花生四烯酸代谢的影响及血管内皮激活的机制

摘要

血管内皮作为多种血管疾病或危险因子作用的靶器官，在血管疾病的病情进展中发挥着无可比拟的作用。因血管内皮细胞具有活跃的内分泌及代谢功能，所以在维持血液的正常流动、调控管壁的张力、参与管壁的炎症与修复等过程中发挥重要的作用。紊乱的内皮功能是多种心血管疾病的共同病理基础，而且血管内皮功能障碍是导致全身脉管系统动脉粥样硬化的血管损伤的早期阶段表现。因此，血管内皮的功能研究对于脉管系统疾病的预防及治疗具有重要意义。本实验室前期研究发现花生四烯酸(arachidonic acid,AA)的CYP450通路代谢酶—可溶性表氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase）通过调控表氧-二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs)和二羟-二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acids,DHETs)在内皮细胞中含量而影响内皮细胞功能。同时，编码可溶性表氧化物水解酶的基因EXPH2受DNA去甲基化调控，影响sEH的表达水平及EETs/ DHETs的比例，进而诱导内皮功能失调。因此，探究AA的代谢平衡对内皮细胞功能具有深远的意义。近年来，在探讨心血管疾病的病因诊断及防治过程中，表观遗传学扮演着至关重要的作用，但表观遗传尤其是DNA甲基化对AA代谢的影响目前鲜有报道。本课题研究目的是探索DNA甲基化对AA代谢通路间平衡的影响，并进一步阐释在低甲基化状态下相关代谢产物发挥的重要作用，以期进一步为相关疾病的研究和治疗提供新的思路。
　　首先我们使用超高效液相色谱质谱联用（LC-MS/MS）检测经甲基化转移酶抑制剂5-Aza-2′-deoxycytidine(5-AZA)处理过的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）内的AA代谢产物的变化。通过检测细胞内AA的COX，LOX及CYP450三大代谢通路中的酶促代谢产物。该代谢组学方法可以定量检测30余种AA的代谢产物。我们发现：AA代谢途径中COX通路代谢酶对甲基化调控更敏感；处理组细胞内容物AA代谢谱明显改变，表现为COX通路代谢产物含量增加，尤其是前列腺素D2(prostaglandin D2，PGD2)和血栓烷素(thromboxane B2,TXB2)显著增加。通过Methyl primer express软件进行生物信息学分析，我们发现与其它两条代谢通路相比，COX通路的代谢酶普遍含有更丰富的CpG岛，受DNA甲基化调控的潜力更大。基于此生物信息学分析结果，通过qPCR验证发现多个COX通路中的代谢酶的基因表达显著升高。在HepG2和HEK293T细胞中验证的结果与信息学分析预测吻合，我们推测 DNA甲基化调控AA代谢酶的表达存在普遍性。进一步，DNA甲基化特异性分析实验证实前列腺素D合酶（PTGDS）和血栓素合酶1（TBXAS1）的基因启动子区甲基化状态发生改变。细胞功能研究发现，5-AZA可以明显增加血管粘附因子(vascular cell adhesion molecule1,VCAM-1)及细胞附分子(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)基因表达水平，诱导内皮细胞的激活。COX通路抑制剂预处理可以显著降低COX通路代谢产物，同时抑制VCAM-1和ICAM-1的表达，提示内皮细胞的激活被抑制。以代谢组学手段分析5-AZA处理的小鼠，结果发现处理组的血浆，肝脏和肾脏的代谢谱结果类似，即：COX通路代谢产物显著升高，与体外实验的AA代谢谱改变一致。同时，经qPCR检测我们发现主动脉及肝脏中PTGDS和TBXAS1基因表达水平也被上调。
　　综上所述，我们得出以下结论：
　　1)DNA甲基化可以调控AA代谢通路中某些关键酶的基因表达水平；
　　2)DNA甲基化在AA代谢平衡中具有重要作用，而且COX通路对于DNA甲基化的调控更敏感；
　　3)PTGDS和TBXAS1因DNA甲基化处理更加敏感，从而在AA代谢平衡的紊乱中发挥重要影响；
　　4)代谢产物前列腺素D2(prostaglandin D2,PGD2)和血栓烷素(thromboxane B2,TXB2)参与5-AZA诱导的内皮细胞活化。
　　总之，DNA甲基化通过调控AA代谢途径关键酶的表达水平，增加相应代谢产物的浓度，进而造成AA代谢平衡的紊乱，内皮细胞的功能失调。

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缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、 DNA 甲基化引起内皮细胞 AA 代谢失衡

1.1 对象和方法

1.2 结果

1.3讨论

1.4小结

二、 DNA 甲基化特异性分析验证甲基化状态改变

2.1 对象和方法

2.2 结果

2.3讨论

2.4小结

三、 DNA 去甲基化诱导 AA 代谢紊乱的病理意义

3.1 对象和方法

3.2 结果

3.3讨论

3.4小结

四、 在体验证DNA 甲基化对AA代谢影响

4.1 对象和方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4小结

全文讨论

全文结论

1、5-AZA 诱导的 DNA 去甲基化使 AA 代谢失衡，且偏向于 COX 通路

2、DNA 甲基化调控敏感酶的表达水平，从而调控 AA 代谢谱的改变

3、DNA 去甲基化诱导内皮细胞内花生四烯酸 COX 通路代谢产物增加进而介导内皮细胞功能失调

论文创新点

1、本文首次以代谢组学手段探究 DNA 去甲基化对 AA 代谢的影响。

2、DNA 去甲基化使 AA 代谢平衡紊乱，并偏向于 COX 通路

3、DNA 去甲基化诱导内皮功能失调部分依赖 PGD2 和 TXB2 参与介导

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 表观遗传学在心血管疾病中的研究进展

致谢