miR-205靶向VEGFA与FGF2调控乳腺癌化疗耐药性

摘要

背景：
　　乳腺癌的多药耐药性(Multidrug Resistance, MDR)是导致化疗失败及复发的最主要原因。肿瘤细胞可随诱导药物、诱导方式、细胞分化阶段及所处微环境的不同而表现出不同的耐药表型。MDR是指肿瘤对一种化疗药物出现耐药的同时对其他结构和功能各异的药物亦产生交叉耐药现象。难以避免的化疗耐药一直是有效控制乳腺癌的关键瓶颈。因此深入的研究乳腺癌的耐药机制,寻找新的耐药相关生物学标志物对于有效逆转化疗耐药,提高乳腺癌的整体治疗水平具有非常重要的理论意义，并且为其临床应用开展提供前期基础。microRNA（miRNA）是由长18~24个核苷酸组成的、内源性高度保守的非编码单链RNA， miRNA发挥作用的机制是通过与靶基因的 mRNA结合进而降解或者抑制其翻译，不同的miRNA可以靶向调控同一靶基因，而一个miRNA在不同情况下可以调控下游不同的靶基因，其基因表达调控方式为我们更加全面地了解肿瘤的发生发展，包括肿瘤细胞的MDR均开拓了更多的思路，对进一步认识和理解肿瘤耐药发生的潜在的分子机制均具有重要意义。在本文的工作中，我们主要对乳腺癌多药耐药相关 miRNA：miR-205在乳腺癌耐药过程中发挥的功能，明确与miR-205直接结合并受其调控的靶基因,及是否通过该靶基因影响乳腺癌的耐药及相关分子机制进行了研究与探讨。
　　方法：
　　1.使用 miRNA芯片对敏感株乳腺癌细胞 MCF-7与耐药株乳腺癌细胞MCF-7/A02中的人源miRNA表达谱进行检测，筛选出在两种细胞系中表达差异最显著的miRNA：miR-205作为后续实验研究的对象。
　　2.用Taqman实时定量PCR的方法在不同乳腺癌细胞及对应耐药细胞株中验证 miR-205表达与肿瘤细胞耐药的相关性，并在其他耐药细胞系进一步验证。并且检测新辅助化疗前乳腺癌组织中 miR-205表达的情况，了解miR-205的表达与乳腺癌新辅助化疗敏感性的关系。
　　3.在MCF-7/A02细胞和CALDOX细胞中用慢病毒感染方式过表达miR-205，以MTT方法检测细胞对阿霉素（DOX）、紫杉醇(Taxol)、依托泊苷（VP-16）的IC50，检测其耐药性的变化；采用平板克隆形成实验方法，评价肿瘤细胞对阿霉素、紫杉醇的敏感性；通过Annexin V/PI染色法，Caspase-3/7活性检测以及Caspase-9检测法等方法检测紫杉醇对目标细胞的凋亡诱导作用，同时使用实时定量PCR法检测凋亡相关基因的mRNA水平改变，采用Western-blotting检测了PI3K/AKT信号转导通路活性及相关凋亡蛋白的改变。
　　4.综合生物信息学预测软件得到miR-205的候选基因VEGFA和FGF2。实时定量PCR方法检测FGF2与VEGFA在MCF-7VS MCF-7/A02细胞和CAL51 VS CALDOX细胞系中的表达差异,同时ELISA法检测四组细胞上清液中VEGFA和FGF2两种因子的变化情况。进一步检测MCF-7/A02和CALDOX两组耐药细胞系转染miR-205后，细胞VEGFA和FGF2基因的变化及上清液中两种因子的变达改变，分析比较各细胞系中miR-205表达、VEGFA和FGF2基础表达水平的相关性。双荧光素酶报告实验验证miR-205和VEGFA3'UTR和FGF23'UTR的靶向关系。
　　5.检测新辅助化疗前乳腺癌组织中VEGFA和FGF2表达情况，分析其表达水平与乳腺癌新辅助化疗敏感性及miR-205的相关性。以MTT方法检测过表达VEGFA和FGF2和沉默两者后细胞对阿霉素、紫杉醇、依托泊苷的IC50，检测其药物敏感性的变化；并进一步检测VEGFA和FGF2对细胞凋亡的影响。
　　6.采用rescue实验检测VEGFA和FGF2的过表达是否可以逆转miR-205对乳腺癌化疗耐药性抑制，以确认VEGFA和FGF2作为miR-205下游功能性的直接靶点调控乳腺癌化疗耐药性：以MTT方法检测处理后各组细胞对阿霉素、紫杉醇、依托泊苷的 IC50，检测其耐药性的变化；采用平板克隆形成实验方法，评价各组细胞对阿霉素、紫杉醇的敏感性；通过Annexin V/PI染色法，Caspase-3/7活性检测以及Caspase-9检测法等方法检测紫杉醇对各组细胞的凋亡诱导作用，同时检测凋亡相关蛋白及 PI3K/AKT信号通路蛋白的变化，以确认 miR-205与VEGFA和FGF2的相互作用对下游通路的影响。
　　7.采用上述方法检测在MCF-7/A02和CALDOX耐药细胞系应用PI3K抑制剂后对凋亡的影响，以进一步证明miR-205对MCF-7/A02与CALDOX细胞化疗敏感性的调控作用是通过影响PI3K/AKT通路活性完成的。
　　8.建立裸鼠皮下移植瘤模型。将 BALB/c裸鼠随机分为四组，将MCF-7/A02-miR-205、MCF-7/A02-NC、CALDOX-miR-205和CALDOX-NC细胞的细胞悬液分别接种于各组裸鼠右腋皮下，约1周后，开始每隔3天清晨用游标卡尺测量小鼠移植瘤最长径L和最短径W，计算肿瘤体积并做好记录。于d15最后一次测量肿瘤体积后，给药DOX（1mg/kg）Taxol（2.5mg/kg）每三天1次腹腔注射。开始每隔3天测量小鼠移植瘤，计算肿瘤体积，于d45最后一次测量肿瘤体积，统一颈椎脱臼处死，剥离瘤块，称重，液氮保存备用。分别取各组瘤组织，实时定量PCR检测MCF-7/A02-miR-205及空白对照细胞移植瘤体中miR-205的表达及VEGFA、FGF2、bax和survivin的表达变化情况。ELISA法检测动物模型血液中VEGFA和FGF2的表达变化。
　　结果：
　　1.对比MCF-7细胞与MCF-7/A02细胞中miRNA芯片表达谱结果，在这两种细胞内共获得19个差异表达的miRNA，结合本课题组前期血清学miRNA检测结果，选定在耐药细胞系中为下调表达的miR-205为进一步的研究对象。
　　2.采用qPCR方法对芯片结果进行验证后发现在乳腺癌MCF-7细胞、Cal51细胞、MTMEC细胞及其对应耐药细胞系中，miR-205在耐药细胞中低表达，同时在白血病K562细胞、HL60细胞、淋巴瘤BJAB细胞及对应耐药细胞中miR-205表达量与耐药性呈负相关性。miR-205表达量与乳腺癌患者新辅助化疗疗效正相关，即miR-205表达越高疗效越好。
　　3.在乳腺癌耐药细胞MCF-7/A02和CALDOX细胞中过表达miR-205后肿瘤细胞对阿霉素的敏感性提高，同时对紫杉醇、依托泊苷的化疗敏感性均有所提高；平板克隆形成实验检测发现，相同化疗药物浓度下， miR-205过表达能抑制MCF-7/A02和CALDOX细胞的克隆形成能力；对于由紫杉醇诱导的细胞凋亡检测实验，过表达miR-205后乳腺癌细胞凋亡程度显著提高；过表达miR-205后，各组细胞凋亡基因Bax mRNA表达增加，抗凋亡基因survivin mRNA表达下降；在蛋白水平的检测中，pAKT表达下降，促凋亡蛋白Bax表达增加，抗凋亡蛋白survivin表达下降。
　　4.生物信息学软件预测显示VEGFA和FGF2mRNA3'UTR和miR-205有两处可以结合的保守序列。VEGFA和FGF2在两种耐药细胞系中表达均高于在对照细胞中的表达，在细胞上清液中的两种因子的表达也明显升高。且在miR-205过表达的乳腺癌细胞系中，miR-205不仅可以在mRNA水平并且也可以在细胞因子水平抑制VEGFA和FGF2的表达。双荧光素酶报告实验中，miR-205可以降低构建的VEGFA3'UTR和FGF23'UTR野生载体的荧光活性。
　　5.分析新辅助化疗前患者乳腺癌组织中miR-205和VEGFA和FGF2表达，发现三者呈负相关，并且miR-205含量越高，患者新辅助化疗疗效越好，而高表达VEGFA和FGF2的患者其新辅助化疗疗效较差。在MCF-7和CAL51细胞中加入VEGFA和FGF2因子后，直接导致细胞对阿霉素的耐药，凋亡减少，Bax的mRNA和蛋白表达均下降，而survivin mRNA和蛋白表达增多，激活PI3K/AKT通路；而外源转入VEGFAsiRNA和FGF2 siRNA的CALDOX细胞，对阿霉素的敏感性提高。
　　6. Rescue实验结果显示，在miR-205稳定转染细胞中转入VEGFA和FGF2后，降低耐药细胞的化疗敏感性，凋亡减少。VEGFA和FGF2过表达后，逆转miR-205促进紫杉醇诱导的细胞凋亡，并且可减弱miR-205对PI3K/AKT通路的削弱作用。Bax的mRNA和蛋白表达均下降，而survivin mRNA和蛋白表达增多。
　　7.MCF-7/A02细胞给予10μM，CALDOX细胞给予2μM PI3K抑制剂LY294002处理24小时，同时添加不同浓度的紫杉醇(0.25μM VS2.5 nM)处理48小时后，Bax的mRNA和蛋白表达均增加，而survivin mRNA和蛋白表达减少。也间接提示 miR-205是通过抑制 PI3K/AKT通路活性来诱导凋亡而增加乳腺癌细胞化疗敏感性的。
　　8.通过裸鼠皮下移植瘤模型证明过表达miR-205能显著抑制MCF-7/A02接种后小鼠肿瘤体积的生长，同时能够提高裸鼠接受紫杉联合蒽环类化疗的敏感性。肿瘤组织中VEGFA、FGF2和survivin表达减少，bax表达增多。小鼠外周血清中VEGFA和FGF2两种因子表达下降。而CALDOX-miR-205细胞接种后的小鼠未见明显成瘤。
　　结论：
　　miR-205在乳腺癌细胞及其他多种肿瘤细胞中与多药耐药性呈负相关。miR-205表达量与乳腺癌患者新辅助化疗疗效正相关，其表达越高疗效越好。在乳腺癌细胞中过表达 miR-205后，肿瘤细胞对阿霉素的敏感性提高，同时对紫杉醇、依托泊苷的化疗敏感性均有所提高；并能促进紫杉醇诱导的细胞凋亡。并且miR-205是直接通过靶向VEGFA和FGF2实现削弱PI3K/AKT通路活性，减少pAKT表达，增加促凋亡蛋白Bax，减少抗凋亡蛋白survivin表达进而实现其促进凋亡影响乳腺癌细胞多药耐药的功能。过表达 miR-205能明显抑制裸鼠移植瘤的生长，并且可以通过抑制VEGFA和FGF2提高肿瘤的化疗敏感性。以miR-205为治疗靶点逆转乳腺癌的耐药，将为乳腺癌的治疗带来新的探索。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、miR-205在乳腺癌耐药细胞的异常表达及其对化疗敏感性的影响

1.1 对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、miR-205靶向VEGFA和FGF2影响乳腺癌耐药细胞的化疗敏感性

2.1 对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

三、miR-205对乳腺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用

3.1 对象和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:miR-205调控肿瘤耐药性及肿瘤干细胞关系的研究进展

致谢

个人简历