母体甲基供体缺乏对子代小鼠实验性结肠炎的影响及可能的表观遗传学机制研究

摘要

目的：
　　溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性、反复发作性的结直肠连续性黏膜炎症性疾病，多以年轻患者多发。但其发病机制仍不明确。目前，认为UC是一种多因素、异质性、多基因遗传的疾病，多种因素包括环境、遗传、感染、免疫、肠道微生物等相互作用的结果。近年来发现表观遗传学是环境与遗传因素之间的桥梁，其中DNA甲基化是重要的表观遗传修饰之一，它能够调节哺乳动物细胞的正常发育、分化，基因表达和染色质结构。DNA甲基化需要甲基供体，包括叶酸、胆碱、B族维生素和甲硫氨酸。DNA高甲基化与基因沉默相关，而低甲基化则基因表达活跃。研究发现在UC患者肠道T淋巴细胞中，IFN-γ表达增加与甲基化水平降低相关，而且IFN-γ基因（IFNG）甲基化水平在调节黏膜细胞因子分泌中有重要作用。众多证据表明在哺乳动物发育过程中，妊娠期和新生儿期的环境因素通过影响表观遗传修饰，导致表型的永久性改变。因此，改变母体饮食因素可能通过影响DNA甲基化参与UC发生、发展。本研究以BALC/c鼠为研究对象，通过给予母鼠甲基供体缺乏饮食，构建子代小鼠实验性结肠炎模型，并检测血清叶酸、维生素B12和同型半胱氨酸水平，结肠黏膜IFN-γ表达水平，以及IFNG启动子区DNA甲基化水平，探讨母体甲基供体缺乏是否通过影响DNA甲基化从而参与UC的发病过程。
　　方法：
　　1.动物模型建立：7周龄BALB/c雌鼠在孕前1个月开始分别喂养标准饮食（C， n=3）和甲基供体缺乏饮食（D，即无叶酸、胆碱、维生素B12和甲硫氨酸， n=4），持续到子代断乳（即出生后21天）；子代小鼠与母鼠相同饮食直到被处死。子鼠出生后第23天，造模组以2.5％葡聚糖硫酸钠溶液（DSS）作为饮用水5天，饮食水量不限。子代小鼠分组如下：C/DSS-组、D/DSS-组、C/DSS+组、D/DSS+组，每组6只。
　　2.结肠炎疾病活动指数（DAI）：每日观察子代小鼠身体状况、体质量、粪便性状、肛周红肿糜烂和便血程度。根据体重减轻程度、粪便性状和便血程度评分，分数范围0-4分，根据DAI=总分数/3（0-4），评估结肠炎症程度。
　　3.采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测子代小鼠外周静脉血清叶酸、维生素B12和同型半胱氨酸（Hcy）水平。
　　4.采用免疫组织化学SP法检测子代小鼠结肠黏膜组织中IFN-γ的表达水平。
　　5.提取结肠组织样本基因组 DNA，经过亚硫酸盐转化，采用 Sequenom MassArray甲基化检测方法检测IFNG启动子区CpG岛甲基化水平。
　　结果：
　　1.甲基供体缺乏的证据：与标准饮食组（C/DSS-和C/DSS+组）相比，甲基供体缺乏饮食组（D/DSS-和D/DSS+组）小鼠的血清叶酸（8.87±1.11比11.34±0.31 nmol/L，P<0.01)、维生素B12（409.2±56.27比676.1±51.66 ng/L，P<0.01）水平均显著降低；同型半胱氨酸（8.45±0.35比6.77±0.36μmol/L，P<0.01）水平显著增高。
　　2.甲基供体缺乏对DAI和组织学评分的影响：在DSS处理后第5天，结肠炎症程度最高。C/DSS+组较C/DSS-组的DAI高，差异有统计学意义（P<0.05）；D/DSS+组较C/DSS+组的DAI增高，差异有统计学意义（P<0.01）,表明甲基供体缺乏饮食更加加重了小鼠结肠炎；C/DSS-组和D/DSS-组的DAI无统计学差异。D/DSS-组组织学评分高于C/DSS-组，D/DSS+组明显高于C/DSS+组，也表明甲基供体缺乏饮食加重了小鼠结肠炎。
　　3.小鼠结肠黏膜组织IFN-γ的表达水平：C/DSS+组和D/DSS+组IFN-γ表达水平较C/DSS-组和D/DSS-组显著增高（2=14.875，P<0.01），而且D/DSS+组较C/DSS+组增高更明显（P<0.01）。
　　4.小鼠结肠黏膜组织IFN-γ表达水平与DAI的相关性：C/DSS+组和D/DSS+组的IFN-γ表达水平与DAI呈正相关（r=0.853、0.840，P均<0.05）。
　　5. IFNG启动子区CpG岛甲基化水平：对同一CpG位点四组样本之间甲基化水平分析未发现明显差异，对四组样本之间所有CpG位点总甲基化水平分析也未发现明显差异。
　　结论：
　　1.母体甲基供体缺乏能够加剧子代小鼠实验性结肠炎发病。
　　2.甲基供体缺乏饮食可以引起子代结肠黏膜IFN-γ表达增高，参与实验性结肠炎发病。
　　3.甲基供体缺乏并非通过 IFNG启动子区 CpG岛低甲基化，从而导致 IFN-γ表达增高，进而加重实验性结肠炎。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、母体甲基供体缺乏对子代小鼠实验性结肠炎的影响

1.1对象和方法

1.1.1 主要仪器

1.1.2 主要试剂

1.1.3 主要溶液的配置

1.1.4 实验动物、饮食和实验性结肠炎的诱导

1.1.5 子代小鼠结肠炎性反应疾病活动指数和组织学评分

1.1.6 血液标本和结肠组织采集

1.1.7 小鼠血清叶酸、维生素B12和同型半胱氨酸的检测

1.1.8 小鼠结肠黏膜组织HE染色组织学评价和IFN-γ的表达检测

1.1.9 统计学分析

1.2实验结果

1.2.1 甲基供体缺乏的证据

1.2.2 甲基供体缺乏饮食对结肠炎严重程度的影响

1.2.3 结肠黏膜组织IFN-γ的表达水平

1.2.4结肠黏膜组织IFN-γ表达水平与DAI的相关性分析

1.3讨论

二、子代实验性结肠炎中干扰素-γ基因甲基化的研究

2.1 对象和方法

2.1.1 主要仪器制冰机

2.1.2 主要试剂

2.1.3 小鼠结肠组织DNA提取和浓度鉴定

2.1.4 引物设计与合成

2.1.5 Sequenom MassArray甲基化检测方法

2.1.6 统计学分析

2.2 结果

2.2.1 结肠组织DNA浓度检测结果

2.2.2 甲基化DNA PCR扩增反应结果

2.2.3 结肠组织IFNG甲基化检测结果

2.3 讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 表观遗传修饰中DNA甲基化在炎症性肠病中的研究进展

致谢

个人简历