BMP-2调控EMT促进伴微钙化乳腺癌转移的机制研究

摘要

目的：钼靶 X线上微钙化表现，经常是提示肿瘤恶性的征象，然而具体机制不详。骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins, BMPs)是TGF-β超家族的重要成员之一，可促进骨、软骨生成，调控细胞增殖和分化，及调节多种脏器生长发育。有研究发现BMPs与异位钙化密切相关，且BMP-2在多种肿瘤有异常表达。本文旨在研究BMP-2在伴微钙化乳腺癌中的表达及与临床病理学特征、预后之间的关系，探究其对乳腺癌的影响及调控机制。
　　方法：
　　1.收集天津医科大学肿瘤医院529例伴微钙化病例，分析微钙化与患者临床病理学特征及预后的关系。并从中选取100例患者，切蜡块进行免疫组化分析，了解其中BMP-2、Runx2、OPN的表达情况，分析BMP-2与预后的关系。
　　2.体外实验验证 BMP-2与乳腺癌细胞生物学行为的关系。选出低表达 BMP-2的细胞系 MCF-7，以及高表达 BMP-2的细胞系 MBA-MD-231，分别通过加rhBMP-2刺激BMP-2表达，以及加入BMP-2抑制剂Noggin来抑制BMP-2的表达，应用 MTT检测 BMP-2对肿瘤细胞增殖的影响，应用平板克隆实验检测BMP-2对细胞克隆形成能力的影响，应用流式细胞术检测BMP-2对细胞凋亡的影响，应用划痕试验和Transwell实验检测BMP-2对侵袭迁徙能力的影响。
　　3.我们对BMP-2调控乳腺癌细胞侵袭转移的机制进行研究，首先利用real-time PCR和Western blot等技术分析细胞系中BMP-2与EMT相关指标的关系，发现其调控EMT的可能，为探究其调控EMT的可能机制，我们应用real-time PCR和Western blot等技术在乳腺癌细胞系验证BMP-2与PI3K/Akt通路相关蛋白的关系。以及加入PI3K/Akt通路抑制剂LY294002后，BMP-2对EMT的调控是否受到抑制来进一步验证其可能的作用通路。
　　4.建乳腺癌移植瘤模型，观察BMP-2对移植瘤的生长、转移等情况的影响，并应用real-time PCR技术和免疫组化方法检测移植瘤中EMT相关蛋白表达的变化。结果：1.伴微钙化乳腺癌患者肿瘤较大、淋巴结转移率较高，并且无进展生存相对较差，伴微钙化为影响预后的独立因素之一。在伴微钙化乳腺癌组织中， BMP-2、Runx2、OPN表达明显增高，提示三者可能参与微钙化形成，异位骨形成可能为微钙化形成的机制之一。BMP-2高表达与患者无进展生存明显相关，为独立预后因素之一。
　　2.外源性rhBMP-2可促进人乳腺癌细胞MCF-7中BMP-2的表达。而BMP-2抑制剂Noggin可以抑制MBA-MD-231细胞中BMP-2表达。体外实验结果显示， rhBMP-2可促进乳腺癌细胞增殖、克隆形成以及迁移侵袭能力，并且可使凋亡能力下降。而Noggin可抑制BMP-2的作用，从而抑制肿瘤增殖、克隆形成，抑制乳腺癌细胞侵袭迁移能力，并且可以促进凋亡。提示BMP-2可促进乳腺癌细胞恶性程度。
　　3.在乳腺癌 MCF-7细胞中，BMP-2的表达与 EMT一些指标显著相关。随着BMP-2浓度增加，上皮表型 E-cadherin、Cx43表达显著下调，而间质表型N-cadherin、FN、Vimentin mRNA表达水平显著上调。BMP-2可促进PI3K/Akt信号通路p-PI3K、p-Akt和p-mTOR表达，进而调控EMT进程。而加入此信号通路抑制剂 LY294002后，p-PI3K、p-Akt、p-mTOR未出现明显的上调，EMT相关指标无明显改变，BMP-2调控EMT的作用明显减弱。可见BMP-2可以通过激活PI3K/Akt信号通路促进MCF-7细胞发生EMT，从而诱导肿瘤侵袭转移。
　　4.应用经BMP-2处理过的乳腺癌MCF-7细胞成功建立BMP-2高表达移植瘤模型。BMP-2组移植瘤增长速度明显快于对照组。BMP-2组出现淋巴结转移以及骨转移的比例明显大于对照组。与对照组相比，BMP-2组E-cadherin表达减弱， Vimentin表达增强，提示出现EMT现象。体内实验进一步验证BMP-2可促进EMT进程，调控乳腺肿瘤转移。
　　结论：
　　1.乳腺癌伴微钙化这一特征与肿瘤恶性度密切相关。
　　2. BMP-2高表达于伴微钙化乳腺癌中，且与转移密切相关，是预后不良的指标。
　　3.经BMP-2刺激后乳腺癌增殖转移能力增强，恶性度提高。
　　4. BMP-2可诱导PI3K/Akt通路关键蛋白磷酸化，调控EMT相关指标变化，诱导EMT进程，从而促进肿瘤转移。
　　5.体内实验证实 BMP-2可促进肿瘤增长以及肿瘤转移，可能作为控制乳腺癌生长转移的新靶点。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、 BMP-2在伴微钙化乳腺癌组织中的表达及其与临床病理学参数的相关性研究

1.1 对象和方法

1.2 结果

1.3讨论

1.4 小结

二、BMP-2对乳腺癌细胞系侵袭影响的体外研究

2.1对象和方法

2.2结果

2.3 讨论

2.4 小结

三、BMP-2通过PI3K/Akt信号通路调控EMT的机制研究

3.1 对象和方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

四、BMP-2调控EMT促进乳腺癌侵袭转移的体内研究

4.1对象和方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述:TGFs/BMPs与肿瘤关系的研究进展

致谢

个人简历