PPA1通过促进上皮-间质转化影响上皮性卵巢癌的转移

摘要

第一部分不同类型的卵巢上皮性肿瘤和正常卵巢组织PPA1的表达
　　目的:明确焦磷酸酶1(PPA1)在上皮性卵巢癌（EOC）、交界性肿瘤、卵巢良性上皮性肿瘤及正常卵巢组织中的表达差异，探讨PPA1表达和与EOC的发生发展及预后的关系。
　　方法:
　　1.应用免疫组化法检测PPA1蛋白在55例EOC、20例交界性卵巢肿瘤、24例卵巢良性上皮性肿瘤和23例人正常卵巢石蜡组织中的表达情况；分析EOC患者PPA1的表达水平与其临床病理参数的关系；对55例EOC患者进行随汸，分析其五年生存率和PPA1蛋白表达的关系。
　　2．Real-time PCR和Westernblot法检测人新鲜EOC组织和正常卵巢组织PPA1 mRNA及蛋白的表达水平。
　　结果:
　　1、免疫组化检测显示，PPA1在正常卵巢和良性卵巢肿瘤组织中低表达，而在卵巢交界性上皮肿瘤和EOC中高表达，并呈逐渐增加的趋势。
　　2、EOC的组织学类型及患者年龄不同，PPA1的表达无显著差异。而 EOC的不同临床分期和病理分级各组间, PPA1的表达有显著差异，PPA1的表达与临床分期和病理分级相关，并随临床分期和病理分级升高而呈升高趋势。与PPA1低表达的患者比较，PPA1表达高的患者五年生存率明显降低。
　　3、人新鲜EOC肿瘤组织的PPA1蛋白及RNA表达均显著高于正常卵巢组织。
　　结论:
　　1. PPA1的表达与人EOC的分级和分期相关。可能在EOC的发生和进展中起重要作用。
　　2. PPA1的表达高低对EOC的预后有一定的预测价值。
　　第二部分用RNA干扰的方法建立PPA1基因敲除的细胞系
　　目的：建立PPA1基因敲除的稳定转染的EOC细胞系，用于进一步研究。
　　方法：
　　1.应用 RNA干扰技术，设计合成2个特异性靶向 PPA1基因的 shRNA载体(PPA1-shRNA表达载体)，同时将空载体作为对照稳定转染至人卵巢癌ES2和SKOV3细胞，并对不同靶点进行有效筛选。
　　2.应用Realtime PCR及Westernblot检测目的基因PPA1的敲除效率。
　　结果：
　　1.本研究应用 RNA干扰技术，成功建立了 PPA1基因敲除的 ES2和SKOV3细胞系。
　　2.检测结果显示：和空白对照组比较,实验组的2个靶向PPA1-shRNA干扰序列中，PPA1在RNA水平和蛋白水平均显著下调达50％以上，2个靶点敲除效率理想。
　　结论:
　　1.RNA干扰技术在在肿瘤学研究中具有重要的价值，同样也可以应用于EOC的研究。
　　2.在本研究中成功建立了PPA1基因敲除的ES2和SKOV3细胞系，这两组细胞系均可用于下一步实验研究。
　　第三部分PPA1对EOC细胞增殖、侵袭、迁移和EMT的影响
　　目的：观察PPA1对EOC细胞的增殖、侵袭、迁移和上皮-间质转化(EMT)的影响从而观察PPA1对肿瘤生物学行为的影响。
　　方法：
　　1. CCK8法检测PPA1基因对EOC细胞ES2和SKOV3增殖的影响。
　　2. Transwell法检测PPA1对EOC细胞ES2和SKOV3侵袭的影响。
　　3.划痕实验检测PPA1对EOC细胞ES2和SKOV3迁移的影响。
　　4.Western blot法检测PPA1对EOC细胞ES2和SKOV3 EMT相关蛋白：E-钙粘素(E-cadherin)、N-钙粘素(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达的影响。
　　5.免疫荧光法检测PPA1对EOC细胞 ES2和 SKOV3 EMT相关蛋白α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和 Vimentin表达的影响。
　　结果：
　　1. CCK8法检测发现，PPA1基因敲除后对于EOC细胞增殖的影响不大。
　　2. Transwell侵袭实验表明，PPA1能够增强EOC细胞的侵袭能力。
　　3.划痕实验表明，在体外，PPA1同样能够促进EOC细胞的迁移能力。
　　4.Western blot法检测发现，敲除PPA1基因后卵巢癌ES2和SKOV3细胞上皮性标志物E-cadherin的表达显著上调，间质性标志物 Vimentin的表达显著下降。间质性标志物N-cadherin在ES2细胞的表达显著下降，而在SKOV3细胞中检测不到。
　　5.免疫荧光法检测发现，敲除PPA1基因后卵巢癌ES2和SKOV3细胞间质性标志物α-SMA和Vimentin的表达均显著下降。
　　结论:
　　1. PPA1具有促进EOC细胞侵袭和迁移的能力，在体外，对于EOC细胞增殖的影响不大。
　　2. PPA1能够促进EOC细胞的EMT。PPA1有可能通过促进EOC细胞的EMT而影响EOC的转移。
　　第四部分PPA1在体内对EOC细胞转移的影响
　　目的：使用动物模型观察PPA1在体内对EOC转移的影响。
　　方法：
　　1.建立NOD/SCID小鼠卵巢癌腹腔移植瘤模型，观察PPA1敲除前后卵巢癌腹腔移植瘤转移能力的变化。
　　2.活体成像法检测 PPA1敲除前后卵巢癌腹腔移植瘤转移能力的变化。
　　3.免疫组化法检测 PPA1敲除前后卵巢癌腹腔移植瘤E-cadherin、Vimentin的表达变化。
　　结果：
　　1.本研究成功建立NOD/SCID小鼠卵巢癌腹腔移植瘤模型，并发现PPA1敲除前可见腹腔内器官及腹膜转移结节，而PPA1敲除后，转移结节少见。
　　2.活体成像法检测也证实了 PPA1有促进卵巢癌腹腔移植瘤转移的作用。
　　3.免疫组化法检测表明，在形成的腹腔移植瘤组织中，相比对照组，敲除 PPA1者 EMT相关蛋白E-cadherin表达升高，而Vimentin表达降低。
　　结论:
　　1.本研究发现 PPA1敲除后小鼠卵巢腹腔移植瘤的转移能力降低。
　　2.在体内，PPA1具有促进卵巢癌细胞EMT的能力，从而促进EOC细胞的转移。
　　第五部分PPA1影响EOC转移机制的探讨
　　目的：初步探讨PPA1影响EOC转移的机制。
　　方法：
　　1.Western blot法检测PPA1敲除后EOC细胞ES2和SKOV3蛋白β-catenin表达的变化。
　　2.免疫荧光法检测PPA1敲除后ES2和SKOV3细胞β-catenin表达的变化。
　　结果：
　　1.Western blot法检测发现，PPA1敲除后总蛋白及核蛋白中β-catenin的表达下降。
　　2.免疫荧光法也证实，PPA1基因敲除后的EOC细胞核的β-catenin的表达下降。
　　结论: Wnt/β-catenin信号通路是肿瘤EMT的重要信号通路之一，PPA1可能通过调节Wnt/β-catenin信号通路影响EOC细胞的EMT，从而促进EOC的转移。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、不同类型卵巢上皮性肿瘤和正常卵巢组织PPA1的表达

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、用RNA干扰的方法在卵巢癌细胞敲除PPA1基因建立稳定转染的细胞系

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

三、PPA1对EOC细胞增殖、侵袭、迁移和EMT的影响

3.1对象和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

四、PPA1在体内对EOC细胞转移的影响

4.1对象和方法

4.2结果

4.3讨论

4.4小结

五、PPA1影响EOC转移机制的探讨

5.1对象和方法

5.2结果

5.3 讨论

5.4小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:焦磷酸酶与恶性肿瘤的研究进展

致谢

个人简历