miR-146a调控Th17细胞分化和功能的体外研究

摘要

目的:
　　研究miR-146a对Th17细胞分化过程和功能的影响并探索可能的调控机制，为调控Th17细胞参与的免疫应答寻找新方法。
　　方法:
　　应用磁珠法分选小鼠脾脏CD4+CD25-初始T细胞，流式细胞术检测目的细胞的纯度；应用抗小鼠CD3/CD28单克隆抗体刺激CD4+CD25-初始T细胞活化增殖后，用miR-146a agomir和antagomir试剂转染调控CD4+CD25-初始T细胞中miR-146a表达水平，实验设置为上调组、下调组以及空白对照组，根据课题组前期实验结果，每组分别设置不同转染浓度亚组，并选取最佳转染浓度；根据文献选取3个不同浓度的 IL-6、TGF-β、抗小鼠 IL-4抗体以及抗小鼠 IFN-γ抗体组合诱导CD4+CD25-初始T细胞向Th17细胞方向分化，验证各方案的诱导效果并选取最佳诱导方案；流式检测各组Th17细胞数目并用ELISA方法检测各组细胞培养体系上清中IL-17水平，QRT-PCR和Western-blot方法检测筛选出的miR-146a可能发挥作用的靶基因的转录及蛋白表达水平。
　　结果:
　　1.磁珠分选前小鼠脾脏CD4+CD25-初始T细胞的比例为24.9%；磁珠分选后CD4+CD25-初始T细胞纯度为92.3%，细胞活性可达到98%。
　　2.成功转染调控CD4+CD25-初始T细胞中miR-146a的表达水平，并且成功诱导CD4+CD25-初始T细胞向Th17细胞方向分化。
　　3.用最佳浓度miR-146a调控试剂转染以及最佳浓度诱导后，上调组、下调组与空白对照组相比Th17细胞数目和上清中IL-17水平不同。流式细胞学检测结果提示，上调组较下调组及空白对照组Th17数目显著增多（P<0.01），下调组较空白组 Th17细胞数目明显减少（P<0.01）；ELISA检测结果显示，上调组较下调组及空白对照组上清中IL-17水平显著升高(P<0.01)，下调组较空白对照组上清中IL-17水平明显降低（P<0.01）。
　　4. QRT-PCR和Western blot结果提示，Th17细胞关键转录因子ROR-γt和IL-17基因的mRNA和蛋白表达水平在上调组与下调组和空白对照组相比，明显升高（P<0.01），在下调组显著降低（P<0.01）；STAT1的表达水平在各组无明显差异（P>0.05）；IRAK1表达水平在上调组较下调组和空白组明显增高（P<0.01）；在下调组中其表达水平明显降低（P<0.01）。
　　结论:
　　1. CD4+CD25-初始T细胞中 miR-146a的表达水平与Th17细胞的分化及其分泌的 IL-17水平呈平行关系，miR-146a表达上调可以促使 Th17细胞数目及IL-17分泌量增多；而miR-146a的表达下调后，Th17细胞数目以及IL-17分泌量也显著降低。
　　2.在 Th17参与的炎性环境中，调控 miR-146a表达水平后，其靶基因之一STAT1的表达水平无显著变化；miR-146a与另一个靶基因IRAK1不再是负性调控关系，miR-146a表达上调后，IRAK1的表达水平也随之升高，这可能与促进Th17细胞的分化及其分泌IL-17能力的有关。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

对象和方法

1．实验对象

2．实验试剂

3．实验仪器

4．实验方法

5．统计方法

结果

1．磁珠法分选获得的CD4+CD25-初始T细胞的纯度及活性检测

2．细胞增殖状态及细胞纯度测定

3．经不同浓度转染后CD4+CD25-初始T细胞miR-146a表达水平

4．经不同浓度细胞因子组合诱导后Th17细胞数目

5．经最佳浓度诱导后不同转染组Th17细胞数目及IL-17表达

6．最佳剂量转染后Th17细胞中相关基因的转录水平

7．最佳剂量转染后Th17细胞中相关基因的蛋白表达水平

讨论

1．Treg细胞的特征、分化和功能

2．Th17细胞的特征、分化和功能

3．miRNA在疾病中对Treg细胞/Th17细胞平衡的影响

4．miR-146a对Treg细胞的调控作用

5．miR-146a对Th17细胞发育的调控作用

6.课题展望

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:miRNA与Th细胞分化的关系

致谢

个人简历