胆碱能抗炎系统在中枢神经系统自身免疫性疾病中的作用机制研究

摘要

目的：内源性/外源性胆碱能抗炎系统在维持内环境的免疫稳态，平衡过度的免疫炎症反应中起到十分重要的作用。中枢神经系统自身免疫性疾病（Central nervous system autoimmune disease）的发生往往伴有外周免疫细胞的浸润、活化，导致神经髓鞘蛋白的脱失，引起多发性硬化症(Multiple Sclerosis, MS)。尼古丁作为胆碱能受体的激动剂，具有外源性胆碱能抗炎作用，可以有效的减少中枢神经系统的免疫细胞，减轻炎症损伤。本研究针对尼古丁的外源性胆碱能作用对中枢神经系统免疫炎症细胞的影响，对细胞发育、分化及迁移的影响进行研究；并对以NK细胞为代表的内源性胆碱能抗炎系统进行探索，确定其随疾病严重程度的改变而发生相应变化，作为一种有效的内源性调节因子控制疾病的进展。这一研究将对完善胆碱能抗炎系统的理解和其治疗机制的探索提供依据。
　　方法：（1）通过对小鼠建立EAE模型并且皮下置入微量注射泵，研究尼古丁对EAE的临床表现的影响。并且探索其对骨髓、外周及中枢的髓系免疫细胞分布和表型的影响。（2）利用流式分选或磁珠分选获得NK细胞后，通过Western Blot和PCR确定NK细胞中是否存在胆碱能合成、转运及代谢的关键酶。胆碱乙酰转移酶（Choline Acetyltransferase, ChAT），胆碱转运子（Choline Transporter, CHT1），囊泡乙酰胆碱转运子（Vesicular acetylcholine transporter, VAChT）以及胆碱酯酶（Acetylcholinesterase, AChE）。（3）利用ChAT-eGFP小鼠建立EAE动物模型后，检测NK细胞在EAE小鼠中ChAT表达水平相对于正常小鼠的变化。（4）流式分选出ChAT+NK细胞和ChAT-NK细胞，利用基因芯片全基因组检测后进行富集分析。（5）通过在CX3CR1-小鼠建立EAE模型，并且向中枢回输ChAT+NK细胞和ChAT-NK细胞，进一步证实和比较ChAT+NK细胞与ChAT-NK细胞在CNS免疫炎症微环境中的作用。（6）ChAT+NK细胞和ChAT-NK细胞回输后对CNS免疫细胞进行流式细胞术检测，明确各个免疫细胞亚群的变化。（7）通过免疫荧光染色和transwell实验探索ChAT+NK细胞与CCR2+Ly6Chi细胞之间的趋化和共定位。（8）免疫荧光染色探索α7nAChR和Perforin在细胞突触间的分布。（9）利用高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）检测多发性硬化症（MS）病人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC）中乙酰胆碱（ACh）水平。
　　结果：（1）在EAE模型中，外源性胆碱能受体激动剂尼古丁可以有效的抑制中性粒细胞和CCR2+Ly6Chi单核细胞向中枢浸润。（2）NK细胞具有完整的胆碱能系统合成及代谢酶，并且可以合成和分泌乙酰胆碱。（3）在EAE中NK细胞ChAT表达增加。并且相对成熟的外周的NK细胞ChAT表达要高于骨髓中的NK细胞。（4）NK细胞ChAT表达与其转移相关受体CX3CR1和介导免疫耐受相关的受体NKG2A表达密切相关。（5）全基因组基因芯片分析发现ChAT+NK细胞相对于ChAT-NK细胞分泌更多的细胞因子和趋化因子，更具有免疫调节功能。（6）把ChAT+NK细胞回输到CX3CR1-/-小鼠的CNS进行功能验证更进一步证实了其免疫调节作用，并且通过抑制杀伤 CCR2+Ly6Chi细胞发挥免疫保护作用。（7） ChAT+ NK细胞与 CCR2+Ly6Chi细胞可以形成免疫突触，并且突触中存在α7nAChR和Perforin的极化及再分布。（8）CCR2+Ly6Chi细胞对ChAT+NK细胞失耐受是由于Qa-1表达下调，而Qa-1表达的下调可能是由于NK细胞分泌的乙酰胆碱通过α7nAChR发挥作用。（9）在MS病人中，我们同样发现病人外周血NK细胞的ChAT表达和乙酰胆碱合成增加，并且在CD56bright NK细胞中这种上调更为显著。
　　结论：（1）外源性胆碱能系统可以通过抑制免疫细胞的浸润而减轻中枢神经系统炎症。（2）NK细胞作为具有抑制 CNS免疫炎症作用的调节性细胞，具备合成和分泌内源性乙酰胆碱的作用。（3）ChAT+NK细胞作为NK细胞的一个亚群，有其特有的免疫特性，并且通过抑制CCR2+Ly6Chi单核细胞在CNS炎症中发挥重要的免疫保护作用。（4）MS病人外周血NK细胞存在胆碱能系统表达的上调，并且与疾病严重程度先关，提示其在反应疾病预后中有一定的意义。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、外源性胆碱能系统在抑制中枢神经系统免疫炎症反应中的作用

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、NK细胞中内源性胆碱能系统在细胞发育分化中的表达

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

三、分泌乙酰胆碱的NK细胞在中枢神经系统自身免疫性疾病中的保护作用

3.1对象和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

四、多发性硬化症病人外周血NK细胞中胆碱能系统的活化

4.1对象和方法

4.2结果

4.3讨论

4.4小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

在学期间参加科研情况

综述:探索非神经性胆碱能抗炎系统在疾病干预中的作用的研究进展

致谢

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