HIF-1α在肿瘤的缺氧微环境中调控LOXL2表达影响肝癌VM形成的研究

摘要

研究背景和目的:
　　近年来，肝癌的发生率和死亡率一直呈现稳定增长的趋势。肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝癌病理分型中最常见的类型。缺氧微环境是实体肿瘤的重要特征，并能够影响肿瘤细胞的侵袭、转移、上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）过程和血管形成。EMT参与了机体胚胎发育和肿瘤进展的过程。血管生成拟态（vasculogenic mimicry,VM）是近年来发现的由肿瘤细胞构成的一种特殊的血液供应模式，不依赖内皮细胞，在管腔中可以观察到红细胞。研究已表明，有VM存在的肿瘤预后差，并且VM可以促进肿瘤的进展过程。
　　HIF-1α是缺氧时关键的调控因子，促进肿瘤细胞更好的适应缺氧，增强自身的存活和肿瘤的发展。LOXL2是铜依赖性单胺氧化酶，能够催化细胞外基质中弹性纤维和胶原纤维的交联。在肿瘤中，LOXL2能促进肿瘤的转移、影响血管的生成，是病人预后的不良因素。最近有研究表明，HIF-1α能促进 LOXL2的表达。本实验通过研究在缺氧微环境中LOXL2在HIF-1α影响肿瘤侵袭、迁移，EMT发生和VM形成中的作用，以及与LOXL2发挥功能的有关的分子机制，从而为肝细胞肝癌的临床治疗提供新的思路和药物靶点。
　　研究方法:
　　一、研究人肝细胞肝癌组织中HIF-1α与LOXL2之间的相关性。收集天津医科大学肿瘤医院和总医院肝细胞肝癌标本201例。这些病人都经过手术切除治疗，具有完整的随访资料。对肝细胞肝癌病理组织切片进行HIF-1α与 LOXL2免疫组织化学染色和 CD31/PAS双重染色，观察并分析HIF-1α与LOXL2的表达和患者性别、年龄、肿瘤病理分级、肿瘤大小、肿瘤转移状况、预后以及和VM的相关性,并通过Pearson相关分析分析HIF-1α与LOXL2表达的相关性。
　　二、HIF-1α通过LOXL2影响EMT发生和VM形成的体外研究。
　　1)对体外培养的肝癌细胞应用二氯化钴（CoCl2）模拟缺氧，转染 HIF-1α下调质粒使HIF-1α的表达下调，应用Western Blot、qRT-PCR和免疫荧光观察HIF-1α对LOXL2表达的影响。
　　2)在缺氧的条件下，转染HIF-1α下调质粒和LOXL2上下调质粒，通过侵袭实验和划痕实验检测 HIF-1α通过调控 LOXL2表达对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响，利用Western Blot和qRT-PCR检测EMT相关指标E-cadherin和vimentin的表达情况。
　　3)利用三维培养模型分析LOXL2在HIF-1α影响肝癌细胞管道形成过程中所起的作用。
　　三、通过Affymetrix HTA2.0基因表达谱芯片分析研究与LOXL2在肿瘤缺氧微环境下发挥作用有关的分子。通过对HepG2-LOXL2、HepG2-缺氧、HepG2-对照三组细胞进行基因表达谱研究，分析与LOXL2在肿瘤缺氧微环境下发挥作用相关的分子。通过PCR对芯片结果进行验证。
　　研究结果:
　　一、在肝细胞肝癌中HIF-1α与LOXL2高表达，HIF-1α阳性患者与LOXL2阳性患者预后较差，HIF-1α表达与LOXL2表达以及VM呈正相关。免疫组化结果显示：在201例肝细胞肝癌病例中，HIF-1α阳性病例94例（46.77%），有 VM存在的患者中 HIF-1α表达明显高于无 VM存在患者（X2=6.270，P=0.012）。通过对肝癌病理分级比较，在Ⅲ、Ⅳ级病人的癌组织中 HIF-1α表达比Ⅰ、Ⅱ级病人要高（X2=4.993，P=0.025）。LOXL2免疫组化结果显示，在201例肝细胞肝癌病例中，LOXL2阳性病例102例（50.75%），有 VM存在的患者中 LOXL2表达明显多于无 VM存在患者（X2=4.830，P=0.028）。在Ⅲ、Ⅳ级病人的癌组织中 LOXL2表达比Ⅰ、Ⅱ级病人要高（X2=4.750，P=0.029）。KM生存分析结果显示，HIF-1α阴性患者比阳性患者生存时间长（P＜0.05），LOXL2阳性患者比阴性患者生存时间短（P＜0.05）。HIF-1α与LOXL2的表达在患者性别、年龄、肿瘤大小以及是否发生转移的差异中没有统计学意义（P>0.05）。Pearson相关分析结果显示在肝细胞肝癌中 HIF-1α表达与 LOXL2表达成正相关（r=0.1990， P=0.004）。
　　二、在肝癌细胞缺氧微环境中，HIF-1α可以调控LOXL2表达影响肝癌细胞侵袭、迁移，EMT发生和VM形成。
　　1、在肝细胞肝癌中，HIF-1α可以调节 LOXL2的表达。在缺氧条件下，下调HIF-1α的表达，可以观察到肝癌细胞的侵袭、迁移和管道形成能力下降， EMT相关分子E-cadherin表达增多，vimentin表达减少。
　　2、在缺氧条件下，下调HIF-1α表达，LOXL2的表达减少。将HIF-1α下调质粒和LOXL2上调质粒共转染后，发现肝癌细胞的侵袭、迁移和管道形成能力增强，同时促进了EMT的发生。
　　3弱了肝癌细胞的侵袭、迁移和管道形成能力，抑制了EMT的发生。、在缺氧时，HIF-1α表达上调，LOXL2表达也随之增加。将LOXL2下调，削弱了肝癌细胞的侵袭、迁移和管道形成能力，抑制了EMT的发生。
　　三、人Affymetrix HTA2.0基因表达谱分析结果
　　1、通过三组细胞的生物学过程的GO分析，发现LOXL2的变化可能引起一些与肿瘤有关的生物学过程的变化。
　　2、在这些有差异表达的基因中，通过 Pubmed搜索其他研究者的文章，分析了fold change≥2的基因的功能，挑选了12个与肿瘤有关的基因进行PCR验证。
　　结论:
　　1、人肝细胞肝癌中，HIF-1α与LOXL2高表达，HIF-1α与LOXL2的表达和肝细胞肝癌的病理分级相关，与 VM相关。HIF-1α和LOXL2阳性患者预后更差。有VM存在的病人比无VM存在的病人预后差。在肝细胞肝癌人体组织标本中，HIF-1α与LOXL2呈正相关关系。
　　2、在人肝癌细胞系Bel7402和HepG2中模拟缺氧，发现HIF-1α可以调控LOXL2的表达，并且HIF-1α可以通过调控LOXL2表达影响肝癌细胞侵袭、迁移， EMT发生以及VM的形成。
　　3、表达谱芯片分析表明，LOXL2过表达和缺氧后，与肿瘤有关的一些生物学功能可能被激活。PCR验证结果表明，在这12个基因中，HLTF, CENPF, ASPM, NIPBL, SLK, PIK3C2A, SMC2, TAF9B和 ATAD2的表达与芯片结果一致， AGL, LRPPRC和ATP5E的表达与芯片的表达不一致。

目录

声明

符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、人肝癌组织中HIF-1α的表达及其与LOXL2表达和临床预后的关系

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、在肿瘤的缺氧微环境下，HIF-1α 可以通过调控 LOXL2表达影响肝癌细胞侵袭、迁移、EMT和VM形成的体外研究

2.1实验对象和方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小结

三、通过表达谱芯片分析LOXL2在肿瘤的缺氧微环境下影响VM和肝癌进展的研究

3.1 实验对象和主要试剂、仪器

3.2 实验方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

全文结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:缺氧微环境与LOXL2在肿瘤中的研究进展

致谢

个人简历