VEGF介导白细胞瘀滞诱发可逆性视网膜血管闭塞及其机制研究

摘要

背景：糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）中重要血管性改变—视网膜血管闭塞与视网膜静脉阻塞（retinal vein occlusion，RVO）继发的视网膜无灌注发生及缺血性视网膜病变成为成年人致盲重要原因。多项临床试验观察 VEGF中和蛋白治疗糖尿病性黄斑水肿（diabetic macular edema，DME）与继发于RVO的黄斑水肿发现，抑制视网膜VEGF不仅能显著改善ME，而且能促进部分已闭塞的血管再通，阻止血管闭塞进展、微血管瘤的发生，提示 VEGF可能在视网膜血管闭塞的发生中作用显著。而糖尿病诱发白细胞瘀滞参与视网膜微血管阻塞发生，因此本课题就 VEGF是否可通过诱发白细胞瘀滞促进视网膜血管可逆性闭塞及其作用机制尚需进一步探讨。
　　目的：（1）探讨 VEGF对视网膜血管内白细胞瘀滞诱导作用；（2）观察 VEGF诱发白细胞瘀滞是否诱发可逆性视网膜血管闭塞及视网膜缺氧发生；（3）探讨阻断VEGF是否能够逆转视网膜血管闭塞；（4）探讨VEGF诱发白细胞瘀滞的作用机制。
　　方法：（1）C57BL/6鼠玻璃体腔注射不同浓度人VEGF（human VEGF， hVEGF）（0、50、100、200、500、1000ng/μl）后，予rhodamine或者FITC标记刀豆素蛋白（conconavalin，ConA）检测视网膜血管内白细胞黏附，并于荧光显微镜下计数。（2）Tet/opsin/VEGF双转基因鼠予四环素诱导视网膜光感受细胞短期内过表达较高量hVEGF；Rhodopsin/VEGF转基因鼠于出生后7天光感受细胞慢性持续性表达低浓度hVEGF，予rhodamine标记ConA标记黏附白细胞并计数。（3）荧光素钠血管造影（sodium fluorescein angiography，FA）后眼底照相观察 hVEGF注射、Tet/opsin/VEGF及Rhodopsin/VEGF鼠视网膜血供情况，FITC-ConA灌注后行视网膜hypoxyprobe染色观察缺氧情况；（4）Tet/opsin/VEGF及Rho/VEGF鼠通过停止四环素诱导关闭 VEGF表达或应用 VEGF trap蛋白 aflibercept后ConA灌注观察白细胞黏附，FA观察视网膜灌注恢复情况。（5）体外VEGF刺激人视网膜微血管内皮细胞（human retinal microvascular endothelial cells，HREC）后实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative Real Time-Polymerase Chain Reaction， qRT-PCR）检测黏附分子：细胞间粘附分子1（intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1）、血管细胞粘附分子1（vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1），选择素（E-selectin，P-selectin），及 NF-κB转录活性；体内 qRT-PCR检测视网膜上述黏附分子及其配体黏附素表达， Western Blot、免疫荧光染色（immunofluorescence assay，IF）检测视网膜VCAM-1的分布及表达；WB视网膜下转染NF-κB（p65）reportor-luciferase载体检测视网膜核NF-κB（p65）的表达及其转录活性。FITC-ConA灌注后视网膜铺片F4/80、Ly6G免疫荧光检测黏附白细胞亚型。（6）尾静脉注射抗VCAM-1抗体及抗VEGFR1抗体后观察白细胞黏附改变。
　　结果：（1）玻璃体腔注射50ng以上VEGF24小时后诱发视网膜血管大量白细胞瘀滞呈剂量、时间依赖性表现为低剂量 VEGF刺激白细胞黏附主要位于分支血管内；大剂量 VEGF刺激白细胞大量瘀滞于扩张静脉及下游血管内。（2） Tet/opsin/VEGF转基因鼠视网膜VEGF表达随时间增加，血管白细胞瘀滞数目相应增加，且单个白细胞或者呈团块状聚集阻塞视网膜血管管腔；四环素诱导后2天、3天FA观察到视网膜静脉明显扩张、大量视网膜渗漏发生、及明显后极部血管闭塞、无灌注发生；且白细胞黏附处视网膜组织hypoxyprobe染色阳性提示缺氧发生；Rho/VEGF鼠于出生后20天开始检测到视网膜白细胞瘀滞发生于7月达到高峰并维持到15月,且黏附主要发生在分支血管、血管分叉处，可见单个细胞阻塞血管管腔；FA可见7月、12月鼠视网膜静脉扩张不明显，血管排布紊乱，后极部多处小面积无灌注发生，部分分布于视网膜下新生血管周围。（3） Tet/opsin/VEGF双转基因小鼠四环素诱导后3天FA检查可见视网膜后极部血管闭塞、小片状无灌注区域，而停止诱导14天后继续FA造影可见已闭塞血管恢复灌注，且ConA标记的黏附白细胞数目较3天时明显减少；应用aflibercept后，部分已闭塞的 Rho/VEGF视网膜血管重新开放，血供恢复，同时周围新生血管也明显减少；而Tet/opsin/VEGF玻璃体腔注射aflibercept后白细胞黏附较对照组明显下降，FA可见视网膜血管形态基本正常、无明显渗漏及视网膜无灌注发生。（4）体外VEGF刺激HRECs4小时后，qPCR检测到VCAM-1、ICAM-1、E-selectin mRNA表达增加，其他黏附分子无明显改变；NF-κB（p65）活性实验检测其转录活性较PBS刺激组明显升高。（5）视网膜qPCR结果发现VEGF注射后24小时、Tet/opsin/VEGF四环素诱导后3天VCAM-1 mRNA水平表达升高，其他黏附分子无明显变化；同时IF发现到VEGF注射后大量VCAM-1表达于表层及内核层视网膜血管；WB检测到Tet/opsin/VEGF鼠高表达VEGF后3天视网膜胞浆蛋白中VCAM-1表达明显升高且阻断VCAM-1后视网膜ConA标记黏附白细胞较IgG组明显减少，同时WB也检测核蛋白中NF-κB于VEGF表达1天后开始升高并维持提示NF-κB被激活；NF-κB（p65）reportor-luciferase检测发现VEGF注射后luciferase活性较PBS注射组明显升高，提示VEGF启动NF-κB转录活性表达，并启动下游因子VCAM-1表达参与白细胞瘀滞发生。（6）视网膜铺片IF检测到部分ConA标记细胞F4/80阳性提示单核细胞VEGF诱导参与白细胞黏附、少部分表现为 Ly6G阳性提示仍有少量中性粒细胞也参与该过程；阻断VEGFR1后，VEGF诱发的视网膜血管内白细胞瘀滞明显下降。
　　结论：1）本研究阐明了视网膜局部VEGF高表达部分能够通过VEGFR1招募白细胞迁移到视网膜血管网，通过激活核转录因子NF-κB启动下游因子VCAM-1表达促进白细胞（单核细胞为主）黏附于视网膜血管内皮细胞，参与血管阻塞，且部分阻塞为可逆性。2）本研究也充分解释临床观察到的缺血性视网膜病变患者眼内注射 VEGF中和蛋白治疗后出现的已经无灌注视网膜血管再灌注及视网膜无灌注进展的减少现象。3）我们研究也表明包括RVO、DR及其他缺血性视网膜病变的病因、病程尽管不同，但是他们均可认为是一类相似疾病即 VEGF是加重疾病急剧进展的重要驱动因子。4）并初步探讨一种潜在单独持续抑制VEGF或联合VEGFR1、VCAM-1可能阻止早期RVO或PDR视网膜血管阻塞及进行性视网膜缺血发生的方法。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、VEGF对视网膜血管白细胞瘀滞影响及继发可逆性视网膜血管闭塞发生

1.1 对象和方法

1.2 结果

1.3 讨论

1.4 小结

二、VEGF激活HRECs促进白细胞黏附发生

2.1 实验对象、主要仪器与试剂

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.4 小结

三、VEGF诱发视网膜白细胞瘀滞机制的研究

3.1对象和方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:糖尿病视网膜病变中白细胞瘀滞发生的机制与作用

致谢

个人简历