实验性淋巴瘀滞诱发家兔肝组织结构病理变化及其与脂肪肝的关系

摘要

肝脏淋巴系统(lymphatic system)不仅是组织回流系统，而且是免疫控制系统。肝脏淋巴管道作为肝组织的回流系统，是对血液回流系统重要的补充，在维持肝脏正常功能中起重要作用。目前对于肝脏静脉、胆管研究的较多，而对于肝脏淋巴管道系统研究较少，尤其是作为肝组织的回流系统，在肝脏脂代谢及脂蛋白转运方面的作用，缺乏研究。
　　本实验分为三部分，通过腹部手术结扎新西兰大白兔腹段胸导管，造成实验性肝淋巴瘀滞的实验动物模型;应用光镜和扫面、透射电镜，观察正常和实验动物肝组织的病理形态学变化;利用酶联免疫吸附法、共聚焦技术，检测肝脏载脂蛋白E和肝X因子受体的变化;探讨肝淋巴瘀滞对肝脏组织结构和脂代谢的影响，实验内容和结果如下:
　　第一部分胸导管结扎诱发家兔肝淋巴瘀滞的形态学观察
　　目的:在腹部手术结扎家兔胸导管，造成肝淋巴回流阻滞，观察实验动物腹腔及肝脏脂肪堆积情况，观察此种方式制造家兔肝淋巴瘀滞动物模型的结果。
　　方法:(1)选用健康清洁级12周龄新西兰大白兔24只，体重1500-1800g，雄性，采用对照研究的方法，随机分为两组，实验（胸导管结扎）组14只和对照（假性手术）组10只;(2)实验开始前1.5小时，用食用大豆油10毫升经灌胃针灌喂家兔，实验开始时，首先用10％水合氯醛(2.4 ml/kg)经新西兰大白兔耳缘静脉注射，深度麻醉，无菌操作，将乳糜池和腹段胸导管清楚的显露，采用自左侧肾上腺上方向上游离出新西兰大白兔腹主动脉1厘米，玻璃分离器将此段腹主动脉挑起，4号缝线将腹段胸导管连同其周围的组织一起结扎。关闭腹腔前，腹腔注射庆大霉素5.0 mg/kg，生理盐水20毫升。对照组只是充分游离胸导管而不结扎。(3)手术环境:操作室为清洁级，手术台清洁，手术操作过程严格遵循无菌操作原则和无菌操作管理制度。(4)术后的新西兰大白兔在洁净的，室温18-24℃，相对湿度60％的环境中分笼饲养，12小时白天、12小时黑夜的生活周期，自由饮水，摄食200g/d（由河北医科大学实验动物中心提供的啮齿类普通食物）。(5)术后6个月，所有的实验和对照动物，在10％水合氯醛（2.4ml/kg）经新西兰大白兔耳缘静脉注射，深度麻醉下，同造模时无菌操作过程，开腹观察新西兰大白兔腹腔和肝脏脂肪堆积情况。
　　结果:
　　1.造模前:肝脏呈鲜红色，质地柔软，边缘锐利，表面光滑，腹腔脂肪较少，肠系膜清亮透明。造模后:(1)实验组:肝脏呈暗红色，质地粗糙，肝脏边缘变圆顿，表面有油腻感，有轻度肝纤维化的感觉，肝脏表面裂隙变宽、变深，伴有肝被膜下脂肪沉积;腹腔脂肪沉积明显增多，肠系膜上可见明显脂肪沉积，并且在肠系膜上可见成串的脂肪球或脂肪泡。(2)对照组:肝脏色泽依旧鲜红，质地依旧柔软，边缘依旧锐利，表而依旧光滑、细腻;腹腔未见脂肪沉积，肠系膜依旧清亮、透明。
　　2.HE染色石蜡切片光镜下观察:(1)对照组新西兰大白兔:肝小叶结构完整:门管区的门静脉、肝动脉及胆管结构完整、清晰，小叶中央静脉完整、清晰;位于小叶中央静脉与汇管区之间的肝细胞排列成索状，肝细胞排列规律，无杂乱，肝血窦未见异常，肝细胞形态规则，细胞内无脂肪滴，无肝细胞疏松变性，未见到肝细胞坏死，肝被膜的扁平上皮细胞排列整齐，被膜下无细胞浸润。(2)实验组新西兰大白兔:肝小叶结构依旧完整:门管区的门静脉、肝动脉及胆管结构完整、清晰，但周围有淋巴细胞浸润，汇管区可见扩张的淋巴管，小叶中央静脉依旧完整、清晰;位于小叶中央静脉与汇管区之间的肝细胞排列成索状，肝细胞排列较规律，无杂乱，肝血窦略显扩张，肝细胞体积增大，肝细胞内可见脂肪滴，可见肝细胞疏松变性，偶见到肝细胞坏死，肝小叶内含有脂肪的肝细胞数目明显增多，而且越接近汇管区肝细胞脂肪变性越轻，小叶中央静脉周围也可见肝细胞脂肪变性，出现少量肝细胞核固缩的现象，肝细胞周围可见以淋巴细胞为主的炎细胞浸润。越是接近肝小叶中央静脉，肝细胞脂肪变性的程度越严重。未见肝小叶结构破坏及异常，未见假小叶。可见肝门管区轻度纤维化。覆盖于肝组织的腹膜上皮扁平，扁平的上皮细胞排列不整齐，上皮下可见淋巴管扩张。
　　3.造模前和造模6个月后体重的变化:实验组术后6个月健康成活8只，体重3000-3500g，平均体重3381.25g，实验前后体重平均增加1718.75±114.06g;对照组术后6个月健康成活8只，体重2500-3000g，平均体重2731.25g，实验前后体重平均增加1093.75±129.69g。造模前和造模6个月后体重的变化:实验组结扎胸导管后体重明显升高，与对照组相比差异具有统计学意义。（P＜0.05）
　　结论:采用手术结扎新西兰大白兔胸导管腹段的方法，可以建立新西兰大白兔肝脏淋巴瘀滞实验动物模型;结扎新西兰大白兔胸导管腹段造成肝脏淋巴瘀滞，肝细胞内脂肪沉积，肝细胞脂肪变性，肝脏脂肪变性，甚至轻度纤维化。
　　第二部分实验性肝淋巴瘀滞诱发肝组织细微和超微结构变化
　　目的:探讨实验性肝淋巴瘀滞对新西兰大白兔肝细胞和肝被膜扁平细胞超微结构的影响。
　　方法:实验用新西兰大白兔选择、饲养、造模等方法同上。术后6个月，所有的实验和对照动物，在10％水合氯醛(2.4ml/kg)经新西兰大白兔耳缘静脉注射，深度麻醉下，同造模时无菌操作过程，开腹:切取临近镰状韧带的小块肝脏组织，用生理盐水、2.5％戊二醛0.1 M磷酸盐缓冲液(pH7.4)依次洗涤，放入2.5％戊二醛0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)保存，备扫描电镜用;切取临近肝表面的小块肝脏组织，用生理盐水、4％戊二醛0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)依次洗涤，放入4％戊二醛0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)保存，备透射电镜用。
　　结果:
　　1.HE染色石蜡切片光镜下观察:同前。
　　2.肝组织表面扫描电子显微镜观察:(1)对照组新西兰大白兔:肝被膜表面扁平的上皮细胞排列整齐，细胞形态规整，扁平上皮细胞表面光滑，其微绒毛主要分布于扁平上皮细胞的边缘，扁平上皮细胞之间的间隙清晰可见，其间微绒毛稀疏，统计三张5000倍扫面电镜下，每张20个较为清晰的扁平上皮细胞之间的间隙，计算扁平上皮细胞之间的间隙大小为1.17um;肝被膜表面的腹膜孔清晰可见，腹膜孔存在于三个相邻上皮细胞之间，其表面可见少量吞噬细胞，统计三张5000倍扫面电镜下，每张20个较为清晰的扁平上皮细胞之间的腹膜孔，计算扁平上皮细胞之间的腹膜孔大小为2.79um。(2)实验组新西兰大白兔:肝被膜表面扁平上皮细胞排列较规整，细胞略呈扁椭圆形，主要存在于扁平上皮细胞边缘的微绒毛增多、变长，原本光滑的扁平上皮细胞表面也覆盖了大量的微绒毛;整个扁平上皮细胞的微绒毛数量呈现增多，不但密布于扁平上皮细胞之间的间隙，还分布于扁平上皮细胞的表面，致使扁平上皮细胞之间的间隙变得不甚清晰;扁平上皮细胞之间的间隙变宽，同样的方法计算间隙大小为2.08um，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);肝被膜表面的腹膜孔清晰可见，存在于三个相邻上皮细胞之间，同样的方法计算腹膜孔大小为3.98um，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），其表面的吞噬细胞数量多，腹膜孔周围可见直径约5-7 um的球形小泡，表面有棘状突起及微绒毛，另外，肝被膜表面可见大量直径约1 um的小泡。
　　3.肝组织超薄切片透射电子显微镜观察:(1)对照组新西兰大白兔:肝细胞超微结构完整、清晰，胞浆丰富，胞浆内富含各种细胞器，肝细胞核居中或略偏，细胞核呈圆形，细胞核大，细胞核内常染色质均匀分布，异染色质很少，核仁清晰，核膜完整、清晰，核膜孔清晰，核膜外的高尔基复合体结构完整、清晰，胞浆可见丰富的内质网和线粒体，线粒体呈杆状、球形，内质网呈管、泡状分布于胞浆各处，细胞浆内含有大量的深色的梅花样的糖原颗粒，细胞浆未见脂滴。细胞浆内有少量的、深色的、体积大小不一的球形溶酶体，散在分布于胞浆各处。肝血窦结构正常，血窦旁可见Kuffer细胞，肝血窦内皮细胞间的内皮间孔未见异常增宽，Kuffer细胞呈不规则形状，细胞核位于一侧，细胞核呈不规则形，核内染色质小均匀，较多异染色质，Kuffer细胞胞浆内含有大量的、深色的、大小不一、球形的溶酶体。位于肝血窦周围的间质间隙未见增宽，可见少量胶原纤维，肝细胞的窦周间隙面可见较多微绒毛。肝细胞间可见毛细胆管，毛细胆管内无瘀胆。两个肝细胞间的间隙未见异常。(2)实验组新西兰大白兔:与对照组相比，肝细胞的超微结构有异常改变，最明显的是肝细胞内出现了较多的脂肪滴，脂肪滴呈大小较均匀的、白色的球形,位于胞浆内，肝细胞核也出现异常改变，肝细胞核核膜间隙增宽，细胞核内出现大量深色的异染色质团块，深色的异染色质团块位于核膜下，出现的染色质边集;胞质内未见深色的梅花样的糖原颗粒;可见双核肝细胞。肝细胞旁的间隙及窦周间隙增宽，窦周间隙内可见储脂细胞，细胞核呈不规则形状，核内染色质不均匀，较多异染色质，成堆的脂肪滴位于细胞核旁，细胞核被推移到细胞的一侧，胞浆内可见含有电子密度致密的核心的分泌颗粒。肝血窦内皮细胞间孔变宽。肝细胞间间隙增宽。窦周间隙及肝细胞周围间质间隙内胶原纤维明显增多。肝细胞间毛细胆管内瘀胆。
　　结论:肝脏淋巴瘀滞，导致肝细胞内脂肪沉积，肝细胞脂肪变性，汇管区纤维化;肝小叶淋巴细胞浸润;肝脏淋巴瘀滞，导致肝被膜扁平上皮细胞的微绒毛增多、变长，扁平上皮细胞之间的间隙变宽，存在于三个相邻上皮细胞之间的腹膜孔也变宽，肝被膜表面可见大量直径约1 um的小泡，并出现淋巴样细胞。
　　第三部分肝淋巴瘀滞诱发肝组织载脂蛋白E和肝X因子受体的变化
　　目的:探讨实验性淋巴瘀滞对肝脂代谢的影响以及可能的机制。
　　方法:实验用新西兰大白兔选择、饲养、造模等方法同上。术后6个月，所有的实验和对照动物，在10％水合氯醛(2.4ml/kg)经新西兰大白兔耳缘静脉注射，深度麻醉下，同造模时无菌操作过程，开腹:切取1.0×1.0×1.0cm大小的肝脏组织，用生理盐水、4％多聚甲醛依次洗涤，放入4％多聚甲醛，备HE染色、免疫组化检查用。肝后下腔静脉取血5ml，经3000 r/min离心10 min分离血清，取上清再经滤纸滤过后，-70℃保存。
　　结果:
　　1.血清血脂四项结果:通过对实验组和对照组2组新西兰大白兔血清胆固醇、游离脂肪酸、甘油三酯和极低密度脂蛋白的水平进行检测和分析，发现实验组新西兰大白兔血清中游离脂肪酸、甘油三酯以及极低密度脂蛋白水平升高，较对照组有明显，差异具有统计学意义(P＜0.05);但是，两组新西兰大白兔的血清胆固醇水平差异不明显，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　2.HE染色石蜡切片光镜下观察:同前。
　　3.免疫荧光化学染色、激光共聚焦显微镜观察:(1)对照组新西兰大白兔:肝组织免疫荧光强度清晰，集中趋势明显，代表载脂蛋白E的绿色荧光主要集中在汇管区，与代表肝X受体的红色荧光集中区域一致，双通道结果显示，两者染色重合的黄色区域并不多，主要集中于汇管区。选取典型区域3个，围绕汇管区划线，统计免疫荧光强度，对照组代表载脂蛋白E的绿色荧光强度为67.31±12.23 AU，代表肝X受体的红色荧光强度为191.17±35.69AU。(2)实验组新西兰大白兔:肝组织免疫荧光强度弱，明显低于对照组，集中趋势与对照组一致。免疫荧光强度分析，不论代表载脂蛋白E的绿色荧光，还是代表肝X受体的红色荧光，强度均较对照组减弱。选取典型区域3个，围绕汇管区划线，统计免疫荧光强度，实验组代表载脂蛋白E的绿色荧光强度为49.56±22.85 AU，代表肝X受体的红色荧光强度为32.84±24.01 AU，实验组荧光强均低于对照组相，差异有统计学意义。(P＜0.05)。
　　4.肝组织超薄切片透射电子显微镜观察:同前。
　　结论:新西兰大白兔肝脏淋巴瘀滞，导致肝细胞内参与脂代谢的载脂蛋白E和肝X受体含量下降，脂蛋白不能通过淋巴途径转运，新西兰大白兔血脂代谢异常，肝细胞内出现脂肪滴，甚至有的肝细胞发生脂肪变性。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 胸导管结扎诱发家兔肝淋巴瘀滞的形态学观察

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 实验性肝淋巴瘀滞诱发肝组织细微和超微结构变化

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 肝淋巴瘀滞诱发肝组织载脂蛋白E和肝X受体的变化

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

参考文献

小结

结论

综述一 载脂蛋白E在脂质转运中的重要作用

综述二 淋巴瘀滞在脂肪肝发生中的重要意义

致谢

个人简历